代謝標識と薄層クロマトグラフィーによる サッカロミセス・セレビシエ における中性脂質合成の解析

アセチルCoAは、膜を構築し、ATPを生成し、細胞シグナル伝達^を調節するための汎用性の高い生体分子通貨として機能する中性脂質(NLs)を含む多様な生体分子の基本的なビルディングブロック^{である1,2。}これらのそれぞれの経路のいずれかにシャントされるLSの可用性は、部分的には、その貯蔵によって調節される。脂質滴(LD)は、トリグリセリド(TG)およびステロールエステル(SE)の疎水性コアからなる細胞質小器官であり、ほとんどの細胞のヌルの主な貯蔵室である。したがって、DLは、分解し、その後生化学的および代謝プロセス^3、4に利用することができるDLを隔離し、調節する。NLおよびLD関連タンパク質の誤調節は、リポジストロフィーおよびメタボリックシンドローム^5,6を含む病理の発症と相関することが知られている。このため、現在のLD研究は、NL合成が空間的、時間的、および多細胞生物の異なる組織にわたってどのように調節されているかに重点を置いて行われています。NLsのユビキタスな細胞の役割のために、DLの合成と調節を担当する多くの酵素は真核生物全体で保存される⁷.実際、一部の原核生物でさえ、DL 8にDL^を保管しています。したがって、サッカロミセス・セレビシエ(出芽酵母)などの遺伝的に難解なモデル生物は、NLの合成および調節の研究に有用であった。

細胞抽出物からのNLの分離と定量は、ガスクロマトグラフィー質量分析(GC-MS)、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、超高性能液体クロマトグラフィー質量分析(UPLC-MS)9、10、11など^、無数の方法で達成できます。おそらく、最も簡単な方法は、薄層クロマトグラフィー(TLC)を介して、標準曲線^12、13からのその後の密度定量を可能にする。TLC は、NLs のコース粒度の分離のみを提供しますが、コストが安価で、複数のサンプルから同時に NL を迅速に分離できるため、強力な手法です。TLCを介してのNLの研究が直面している最もかなりの課題の2つは、1)NL種とその中間体の細胞豊富の広い範囲、および2)NL合成経路内の脂質中間体の親水性/疎水性の範囲である。その結果、TLCを介したNL種の定量は、典型的には最も豊富な種に限定される。しかし^、14C-酢酸放射標識の導入は、NL経路内の低存在性中間体の検出を有意に高めることができる。酢酸はアセチルCoA合成酵素ACS2¹⁴によってアセチルCoAに急速に変換され、これは^14C-酢酸を酵母¹⁵において適切な放射性標識基質にする。さらに、疎水性のNLsとNの親水性中間体の両方の分離は、複数の溶媒システム¹⁶を使用することにより、TLCによって達成することができる。ここでは、酵母における¹⁴のC-酢酸代謝標識を用いたNLsの分離方法を提示する。パルス期間中に標識された脂質は、その後、十分に確立された全脂質単離プロトコル¹⁷によって単離され、続いてTLCによるNL種の分離が続く。標識脂質を可視化するオートラジオグラフィーと、全脂質を可視化する化学スプレーの両方によるTLCプレートの開発は、複数の定量方法を可能にする。個々の脂質バンドはまた、カミソリの刃を使用してTLCプレートから容易に抽出することができ、およびシンチレーションカウントは、バンド内の放射性標識材料の量を定量するために使用することができる。