Yüksek Verim Ekstrasellüler Vezikül Preparatlarının Virüsten Uzaklaştırılması
Summary
Bu protokol, ev çökeltme, yoğunluk gradyan ultracentrifugation ve parçacık yakalama birleştirerek yüksek verimlilik ve verim ile virions uzak hücre dışı veziküller (EVs) izole aerodinamik bir iş akışı ve başlangıç bir azalma sağlamak için tüm EV araştırmalarında kullanılmak üzere tekrarlanabilir preparatlar ile sonuçlanan hacim gereksinimleri.
Abstract
Bir ekstrasellüler vezikül alanında önemli engellerden biri (EV) araştırma bugün viral bir enfeksiyon ortamında saflaştırılmış EV preparatları elde etmek için yeteneğidir. Sunulan yöntem, evleri virions’lardan (yani HIV-1) izole etmek ve geleneksel ultrasantrifüj yöntemlerine göre daha yüksek verimlilik ve verim sağlamak için tasarlanmıştır. Protokolümüz üç adımdan oluşur: EV çökeltme, yoğunluk gradyan ayırma ve parçacık yakalama. Downstream tahlilleri (yani, Western blot ve PCR) parçacık yakalama dan sonra doğrudan çalıştırılabilir. Bu yöntem, minimum başlangıç hacimlerinin kullanımına izin verdiği için diğer yalıtım yöntemlerine (örn. ultracentrifugation) göre avantajlıdır. Ayrıca, birden fazla ultrasantrifüj adımı gerektiren alternatif EV yalıtım yöntemlerinden daha kullanıcı dostudur. Ancak, sunulan yöntem bizim parçacıklardan bozulmamış EVs eute zor olduğu gibi fonksiyonel EV tahlilleri kapsamında sınırlıdır. Ayrıca, bu yöntem kesinlikle araştırma tabanlı bir ortama göre uyarlanmıştır ve ticari açıdan uygun olmayacaktır.
Introduction
Araştırma ekstrasellüler veziküller etrafında merkezli (EVs), özellikle ekzozomlar, 30-120 nm arasında değişen ve üç tetraspanin belirteçleri CD81, CD9 ve CD63 varlığı ile karakterize EV türü, büyük ölçüde izole etmek ve yöntemlerinin geliştirilmesi ile şekillenmiştir ilgi vezikülleri arındırmak. Çok yönlü mekanizmaları inceleme yeteneği, çok çeşitli içeriklere, boyutlara ve farklı yollardan üretilen heterojen vezikül popülasyonundan oluşan örnekler üreten karmaşık ve zaman alıcı teknikler nedeniyle engellenmiştir. Yoğun -luğunu. Bu hemen hemen tüm EV araştırma için bir sorun olmakla birlikte, virions ve virüs benzeri parçacıklar (VLPs) ilgi vezikülleri çapı benzer olabilir gibi, viral enfeksiyon bağlamında EVs incelerken özellikle önemlidir. Örneğin, İnsan İmmün Yetmezlik Virüs Tip 1 (HIV-1) yaklaşık 100 nm çapında, kabaca evs birçok türde aynı boyuttadır. Bu nedenle, bu sorunları gidermek için yeni bir EV yalıtım iş akışı tasarladık.
EV izolasyonunun mevcut altın standardı ultrasantrifüjdür. Bu teknik çeşitli vezikül yoğunlukları kullanır, hangi veziküller her aşamada daha düşük yoğunluklu parçacıklar karşı yüksek yoğunluklu parçacıkların diferansiyel sedimantasyon ile santrifüj ile ayrılmasını sağlar 1,2. Bozulmamış hücreleri (10 dk için 300-400 x g), hücre enkazı (10 dk için~2.000 x g) ve apoptotik cisimler/büyük vezikülleri (10 dk için~10.000 x g) kaldırmak için birkaç düşük hızlı santrifüj adımı gereklidir. Bu ilk arıtmalar yüksek hızlı ultracentrifugation (100.000-200.000 x g 1.5-2 h) tortu EVs tarafından takip edilir. Yıkama adımları daha fazla EV saflık sağlamak için yapılır, ancak, izole EVs sayısının azaltılması bu sonuç, böylece toplam verim düşürücü 3,4. Bu yöntemin yardımcı programı, yeterli sonuçlar elde etmek için çok sayıda hücre (yaklaşık 1 x 108)ve büyük bir numune hacmi (> 100 mL) gereksinimi ile daha da sınırlıdır.
Artan endişeleri gidermek için, hidrofilik polimerler ile veziküllerin yağış son yıllarda yararlı bir teknik haline gelmiştir. Polietilen glikol (PEG) veya diğer ilgili çökeltme reaktifleri, kullanıcının numune içindeki vezikülleri, virüsleri ve protein-RNA agregalarını sadece tercih edilen reaktifle kuluçkaya yatırarak ve ardından tek bir düşük hız agregasını aşağı çekmesine olanak tanır. santrifüj1,2,5. Daha önce peg veya ilgili yöntemlerin kullanımı nın geleneksel ultrasantrifüj sonuçlarına kıyasla EV’leri çökertmek için önemli ölçüde daha yüksekverim6 olduğunu bildirmiştik. Bu strateji hızlı, kolay, ek pahalı ekipman gerektirmez, kolayca ölçeklenebilir ve EV yapısını korur. Ancak, bu yöntemin promiscuous doğası nedeniyle, ortaya çıkan örnekler serbest proteinler, protein kompleksleri, EV’ler bir dizi ve böylece istenilen popülasyon elde etmek için daha fazla saflaştırma gerektiren virions dahil olmak üzere çeşitli ürünler içerir1 ,2,7,8.
Çeşitli yağış yöntemlerinden elde edilen EVs heterojenliği aşmak için, yoğunluk gradyan ultracentrifugation (DG) yoğunluğuna göre parçacıkları daha iyi ayırmak için kullanılır. Bu yöntem, iodixanol veya sakaroz gibi, eVs’lerin proteinlerden, protein komplekslerinden ve virüs veya virüs benzeri parçacıklardan (VLP) ayrılmasına olanak tanıyan bir yoğunluk gradyan ortamı kullanılarak adım adım gradyan kullanılarak gerçekleştirilir. Bir zamanlar DG’nin EV alt popülasyonlarının daha kesin ayrılmasına izin verdiği düşünülse de, çeşitli veziküllerin boyutlarının ve yoğunluklarının örtüştüğü bilinmektedir. Örneğin, ekzozomların yüzdürme yoğunlukları 1.08-1.22 g/mL9olarak bilinirken, Golgi’den izole edilen veziküllerinyoğunluğu 1.05-1.1.12 g/mL ve endoplazmik retikulum (COPII+ ) 1,18-1,25 g/mL1,2,3,4,9de tortu . Ayrıca, eğer bir viral parçacıklar içeren fraksiyonları karşı ekzozomal kesirler karşılaştırmak için arzu, bu ilgi virüsün yoğunluğuna bağlı olarak daha zor olabilir-hiv-1 dışında virüsler var ki büyük olasılıkla aynı dengelemek ekzozomal pozitif kesirler2 olarak yoğunlukları .
Son olarak, downstream görselleştirme ve fonksiyonel tahliller için EV preps zenginleştirme EV araştırma için hayati önem taşımaktadır. EV zenginleştirici nano tanecikleri kullanımı, özellikle, çapı 700-800 nm aralığında çok fonksiyonlu hidrojel parçacıkları, konsantre EV preps ulaşmada kritik bir adımdır. Onlar seçicilik teşvik etmek için gözenekli bir dış sieving kabuk tarafından kapsüllenmiş yüksek bir affinity aromatik yem sahip. Bu çalışmada kullanılan nano partiküller farklı çekirdek yemleri (Reaktif Kırmızı 120 NT80; ve Cibacron Mavi F3GA NT82) çeşitli reaktifler ve biyoakışçılar DAN EVs yakalama artırmak için göstermiştir iki farklı preparatlar içerir (Malzemeler Tablosu bakınız )6,10,11,12,13,14,15. Parçacıklar iodixanol fraksiyonları, hücre kültürü supernatant yanı sıra plazma, serum, serebral spinal sıvılar (BOS) veidrar6 gibi hasta biyosıvıları da dahil olmak üzere çok sayıda başlangıç malzemelerinden EVs kolay zenginleştirme sunuyoruz,13 .
Burada sunulan yöntem çeşitli teknolojileri birleştirerek mevcut EV arıtma tekniklerinin verimliliğini artırır; EV yağış, yoğunluk gradyan ultracentrifugation, ve parçacık yakalama, iş akışını kolaylaştırmak için, örnek gereksinimlerini azaltmak, ve tüm EV araştırmalarında kullanılmak üzere daha homojen bir EV örnek elde etmek için verimi artırmak. Bu yöntem, büyük, istenmeyen vezikülleri ve VLP’leri dışlamak için 0,22 μm filtrasyon adımı içerdiğinden ve toplam EV popülasyonunun yoğunluğuna göre etkin bir şekilde ayrılmasını içerdiğinden, bu yöntem viral enfeksiyon sırasında evlerin ve içeriğinin araştırılmasında özellikle yararlıdır. EVs’leri virions’tan izole edin.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ana hatlarıyla kullanılan yöntem, gelişmiş EV verimi ve virüsün izolasyona kombinasyon yaklaşımı kullanarak EV’lerden ayrılmasına olanak tanır. Nispeten büyük miktarlarda başlangıç malzemesi (örn. hücre süpernatantı) EV izolasyonundan önce çökelme, DG ayrıştırma ve nanopartikül zenginleştirme ile filtrelenebilir ve bu da ~30 μL’lik son bir hacimle sonuçlanabilir ve bu da çeşitli alanlarda hemen kullanıma olanak sağlar. downstream tahlilleri. Nanopartikül zenginleştirme kullanımı, g…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Keşançi laboratuvarının tüm üyelerine teşekkür etmek istiyoruz, özellikle Gwen Cox’a. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Hibeleri (AI078859, AI074410, AI127351-01, AI043894 ve NS099029 to F.K.) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| CEM CD4+ Cells | NIH AIDS Reagent Program | 117 | CEM |
| DPBS without Ca and Mg (1X) | Quality Biological | 114-057-101 | |
| ExoMAX Opti-Enhancer | Systems Biosciences | EXOMAX24A-1 | PEG precipitation reagent |
| Exosome-Depleted FBS | Thermo Fisher Scientific | A2720801 | |
| Fetal Bovine Serum | Peak Serum | PS-FB3 | Serum |
| HIV-1 infected U937 Cells | NIH AIDS Reagent Program | 165 | U1 |
| Nalgene Syringe Filter 0.2 µm SFCA | Thermo Scientific | 723-2520 | |
| Nanotrap (NT80) | Ceres Nanosciences | CN1030 | Reactive Red 120 core |
| Nanotrap (NT82) | Ceres Nanosciences | CN2010 | Cibacron Blue F3GA core |
| Optima XE-980 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma-Aldrich | D1556-250mL | Iodixanol |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Ultra-Clear Tube, 14x89mm | Beckman Coulter | 344059 |
References
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods (San Diego, Calif). 87, 3-10 (2015).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends. BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).
- Momen-Heravi, F., et al. Current methods for the isolation of extracellular vesicles. Biological Chemistry. 394 (10), 1253-1262 (2013).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , (2006).
- Boriachek, K., et al. Biological Functions and Current Advances in Isolation and Detection Strategies for Exosome Nanovesicles. Small (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (6), (2018).
- DeMarino, C., et al. Antiretroviral Drugs Alter the Content of Extracellular Vesicles from HIV-1-Infected Cells. Scientific Reports. 8 (1), 7653 (2018).
- Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Raposo, G., et al. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. The Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).
- Sampey, G. C., et al. Exosomes from HIV-1-infected Cells Stimulate Production of Pro-inflammatory Cytokines through Trans-activating Response (TAR) RNA. The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1251-1266 (2016).
- Ahsan, N. A., et al. Presence of Viral RNA and Proteins in Exosomes from Cellular Clones Resistant to Rift Valley Fever Virus Infection. Frontiers in Microbiology. 7, 139 (2016).
- Barclay, R. A., et al. Exosomes from uninfected cells activate transcription of latent HIV-1. The Journal of Biological Chemistry. 292 (28), 11682-11701 (2017).
- Pleet, M. L., et al. Ebola VP40 in Exosomes Can Cause Immune Cell Dysfunction. Frontiers in Microbiology. 7, 1765 (2016).
- Pleet, M. L., et al. Ebola Virus VP40 Modulates Cell Cycle and Biogenesis of Extracellular Vesicles. The Journal of Infectious Diseases. , (2018).
- Anderson, M. R., et al. Viral antigens detectable in CSF exosomes from patients with retrovirus associated neurologic disease: functional role of exosomes. Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 24 (2018).
- Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochimica Et Biophysica Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
- Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews. Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
- Schwab, A., et al. Extracellular vesicles from infected cells: potential for direct pathogenesis. Frontiers in Microbiology. 6, 1132 (2015).
- Narayanan, A., et al. Exosomes derived from HIV-1-infected cells contain trans-activation response element RNA. The Journal of Biological Chemistry. 288 (27), 20014-20033 (2013).
- Sami Saribas, A., Cicalese, S., Ahooyi, T. M., Khalili, K., Amini, S., Sariyer, I. K. HIV-1 Nef is released in extracellular vesicles derived from astrocytes: evidence for Nef-mediated neurotoxicity. Cell Death & Disease. 8 (1), e2542 (2017).
- Yang, L., et al. Exosomal miR-9 Released from HIV Tat Stimulated Astrocytes Mediates Microglial Migration. Journal of Neuroimmune Pharmacology: The Official Journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 13 (3), 330-344 (2018).
- Arakelyan, A., Fitzgerald, W., Zicari, S., Vanpouille, C., Margolis, L. Extracellular Vesicles Carry HIV Env and Facilitate Hiv Infection of Human Lymphoid Tissue. Scientific Reports. 7 (1), 1695 (2017).
- Jaworski, E., et al. Human T-lymphotropic virus type 1-infected cells secrete exosomes that contain Tax protein. The Journal of Biological Chemistry. 289 (32), 22284-22305 (2014).
- Heinemann, M. L., et al. Benchtop isolation and characterization of functional exosomes by sequential filtration. Journal of Chromatography. A. 1371, 125-135 (2014).
- McNamara, R. P., et al. Large-scale, cross-flow based isolation of highly pure and endocytosis-competent extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1541396 (2018).
- Heinemann, M. L., Vykoukal, J. Sequential Filtration: A Gentle Method for the Isolation of Functional Extracellular Vesicles. Methods in Molecular Biology. 1660, 33-41 (2017).
- Busatto, S., et al. Tangential Flow Filtration for Highly Efficient Concentration of Extracellular Vesicles from Large Volumes of Fluid. Cells. 7 (12), (2018).
- Andriolo, G., et al. Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method. Frontiers in Physiology. 9, 1169 (2018).
- Pleet, M. L., et al. Autophagy, EVs, and Infections: A Perfect Question for a Perfect Time. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 362 (2018).
- Richards, A. L., Jackson, W. T. Intracellular Vesicle Acidification Promotes Maturation of Infectious Poliovirus Particles. PLoS Pathogens. 8 (11), (2012).
- Taylor, M. P., Kirkegaard, K. Modification of Cellular Autophagy Protein LC3 by Poliovirus. Journal of Virology. 81 (22), 12543-12553 (2007).
- Jackson, W. T., et al. Subversion of cellular autophagosomal machinery by RNA viruses. PLoS biology. 3 (5), e156 (2005).
- Suhy, D. A., Giddings, T. H., Kirkegaard, K. Remodeling the Endoplasmic Reticulum by Poliovirus Infection and by Individual Viral Proteins: an Autophagy-Like Origin for Virus-Induced Vesicles. Journal of Virology. 74 (19), 8953-8965 (2000).
