טיהור של תשואה גבוהה לחילוץ ההכנות הרחק וירוס
Summary
פרוטוקול זה מבודד ושלפוחיות שלפוחית (EVs) הרחק מריטונים עם יעילות גבוהה ותשואה על ידי שילוב משקעים EV, צפיפות הדרגתי מעבר הצבע, ולכידת חלקיקים כדי לאפשר זרימת עבודה יעילה והפחתה של התחלת דרישות נפח, וכתוצאה מכך ההכנות לשימוש בכל מחקר EV.
Abstract
אחד המכשולים העיקריים בתחום של שלפוחית לפוחית מחקרית (EV) מחקר היום היא היכולת להשיג ההכנות EV מטוהרים בסביבה זיהום נגיפי. השיטה המוצגת נועדה לבודד את EVs הרחק מן הריטונים (כלומר, HIV-1), המאפשר יעילות גבוהה יותר ותשואה בהשוואה לשיטות המקובלות המקובלת. הפרוטוקול שלנו מכיל שלושה שלבים: משקעים EV, צפיפות מעבר הצבע ולכידת חלקיקים. במורד הזרם (כלומר, אבן החשופה המערבית ו-PCR) ניתן להפעיל ישירות לאחר לכידת החלקיקים. שיטה זו היא יתרון על שיטות אחרות בידוד (כלומר, ultracent, באמצעות) כפי שהיא מאפשרת שימוש באמצעי אחסון מינימלי המתחיל. יתר על כן, הוא ידידותי יותר למשתמש מאשר שיטות חלופיות EV בידוד המחייב שלבים מרובים ultracentהדו. עם זאת, את השיטה המוצגת מוגבלת היקף הפונקציונלי של EV בחני כפי שקשה לעשות EVs שלם מתוך החלקיקים שלנו. יתרה מזאת, שיטה זו מותאמת להגדרה מבוססת מחקר בלבד ולא תהיה מבחינה מסחרית.
Introduction
מחקר ממורכז סביב שלפוחיות ושלפוחית (EVs), במיוחד אקסוזומים, סוג של EV החל 30-120 ננומטר ומאופיין על ידי נוכחות של שלושה הטטרספב סמנים CD81, CD9, ו CD63, יש בעיקר עיצב על ידי פיתוח שיטות לבידוד ו לטהר את שלפוחית העניין. היכולת לבתר את המנגנונים הפנים היתה מעכבת עקב טכניקות מורכבות וגוזלת זמן היוצרות דגימות המורכבות מאוכלוסיה הטרוגנית של ושלפוחיות באמצעות מסלולים שונים עם מגוון רחב של תוכן, גדלים ו צפיפויות. בעוד זה בעיה עבור כמעט כל מחקר EV, זה חשוב במיוחד כאשר לימוד EVs בהקשר של זיהום נגיפי, כמו הריטונים וחלקיקים כמו וירוס (אחמי ם) יכול להיות דומה בקוטר של שלפוחיות של ריבית. לדוגמה, הנגיף החיסוני האנושי סוג 1 (HIV-1) הוא כ 100 ננומטר בקוטר, וזה בערך באותו גודל כמו סוגים רבים של EVs. מסיבה זו, עיצבנו עבודה בידוד EV הרומן כדי לטפל בנושאים אלה.
התקן הזהב הנוכחי של EV בידוד הוא מאוד. טכניקה זו עושה שימוש בצפיפויות שונות של שלפוחית השמש, אשר מאפשר שלפוחיות להיות מופרדים על ידי צנטריפוגה עם משקעי דיפרנציאליות של חלקיקים בצפיפות גבוהה יותר לעומת חלקיקי צפיפות נמוכה בכל שלב 1,2. כמה צעדים צנטריפוגה במהירות נמוכה נדרשים להסיר תאים שלמים (300-400 x g עבור 10 דקות), פסולת תא (~ 2,000 x g עבור 10 דקות), ו האפוטוטיק גופים/שלפוחיות גדולות (~ 10,000 x g עבור 10 דקות). הפוריאות הראשונית מלווה במהירות גבוהה (100,000-200000 x g עבור 1.5-2 h) כדי משקעים EVs. לשטוף את השלבים מבוצעים כדי להבטיח את הטוהר EV, אולם, התוצאה היא ירידה של מספר EVs מבודדים, ובכך הפחתת התשואה הכוללת 3,4. כלי השירות של שיטה זו מוגבל עוד יותר על-ידי דרישת מספר גדול של תאים (כ 1 x 108) ונפח גדול לדוגמה (≫ 100 mL) כדי להשיג תוצאות מתאימות.
כדי לטפל בחששות ההולכת וגוברת, משקעים של שלפוחיות עם פולימרים הידרופילי הפכו לטכניקה שימושית בשנים האחרונות. פוליאתילן גליקול (פג), או ריאגנטים משקעים קשורים אחרים, מאפשר למשתמש למשוך למטה את שלפוחיות, וירוסים, חלבון או חלבון-RNA אגרגטים בתוך מדגם על-ידי מודסת את המדגם עם מגיב הבחירה, ואחריו מהירות אחת נמוכה צנטריפוגה1,2,5. אנו דיווחו בעבר כי השימוש ב-יתד או שיטות הקשורות לזרז EVs בהשוואה לתוצאות מסורתיות ה, בתשואה גבוהה משמעותית6. אסטרטגיה זו היא מהירה, קלה, אינה דורשת ציוד יקר נוסף, הוא מדרגי בקלות, ושומר על מבנה EV. עם זאת, בשל האופי המופקר של שיטה זו, הדגימות המתקבלות מכילות מגוון של מוצרים, כולל חלבונים בחינם, מכלולי חלבונים, מגוון של EVs, והריטונס ובכך דורשים טיהור נוסף כדי להשיג את האוכלוסייה הרצויה1 ,2,7,8.
כדי להתגבר על הטרוגניות של EVs שהתקבלו משיטות משקעים שונות, צפיפות מעבר הצבע הדרגתי (DG) מנוצל לחלקיקים נפרדים יותר מבוסס על הצפיפות שלהם. שיטה זו מבוצעת באמצעות מעבר הדרגתי באמצעות בינוני מעבר הדרגתי, כגון יודיאקרול או סוכרוז, המאפשר הפרדת EVs מחלבונים, מכלולי חלבונים, וירוסים או חלקיקים כמו וירוס (אחמי ם). חשוב לציין, שבזמן שבעבר חשבו שDG מאפשרת הפרדה מדויקת יותר של אוכלוסיות המשנה EV, ידוע כיום כי גדלים וצפיפויות של שלפוחיות שונות יכולות לחפוף. למשל, אקסוזומים ידועים שיש צפיפות ציפה של 1.08-1.22 g/mL9, ואילו שלפוחיות מבודדות מ-golgi (copi+ או clathrin רין+) יש צפיפויות של 1.05-1.12 g/mL ואלה מתוך הרשתית רשתית פלזמית (copi+ ) משקע ב-1.18 1.25 גרם/mL 1,2,3,4,9. בנוסף, אם אדם משתוקק להשוות שברים אקזומליים נגד שברים המכילים חלקיקים נגיפי, זה עשוי להיות קשה יותר בהתאם לצפיפות של וירוס של עניין-יש וירוסים אחרים מאשר HIV-1 כי סביר להניח באופן זהה צפיפויות שברים חיוביים שלאקזומ2.
בסופו של דבר, העשרה של EV שיטת ‘ עבור הדמיה במורד הזרם ומוסר פונקציונלי חיוני למחקר EV. השימוש בחלקיקים EV-מעשיר, במיוחד, רב תפקודי הידרוג’ל חלקיקים כי טווח 700-800 ננומטר בקוטר, הם צעד קריטי בהשגת מרוכז EV preps. הם בעלי פיתיון ארומטי בעלי אהדה גבוהה אשר כשעברו על ידי מעטפת ניפוי החיצונית נקבובי לקדם סלקטיביות. חלקיקי חלקיקים מנוצל במחקר זה כוללים שתי הכנות שונות עם פיתיונות ליבה שונה (מגיב אדום 120 NT80; ו cibacron כחול F3GA NT82) אשר הראו כדי להגדיל את הלכידה של EVs מתוך ריאגנטים שונים ביולואידים (לראות את הטבלה של חומרים )6,10,11,12,13,14,15. החלקיקים מציעים העשרה קלים של EVs מחומרי התחלה רבים כולל שברים יודיקסרול, התרבות התאית סופרנטאנט, כמו גם ביולואידים מטופלים כגון פלזמה, סרום, נוזלי עמוד השדרה מוחין (שדרתי), ושתן6,13 .
השיטה המוצגת כאן משפרת את היעילות של טכניקות הטיהור הנוכחיות של EV על ידי שילוב של מספר טכנולוגיות; EV משקעים, צפיפות מעבר הצבע הדרגתי, ולכידת חלקיקים, כדי לייעל את זרימת העבודה, להפחית את הדרישות לדוגמה, ולהגדיל את התשואה כדי להשיג מדגם הומוגנית יותר EV לשימוש בכל EV מחקר. שיטה זו היא שימושית במיוחד בחקירת EVs ותוכנם במהלך זיהום נגיפי כפי שהיא כוללת צעד סינון 0.22 יקרומטר כדי להוציא את החלק הגדול, לא רצוי ושלפוחיות מים והפרדה של אוכלוסיית EV סה כ מבוסס על צפיפות כדי ביעילות בודד את EVs מהריטונים
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה המותווה מאפשרת תשואה EV משופרת והפרדת הווירוס מ-EVs באמצעות גישה משולבת לבידוד. כמויות גדולות יחסית של חומרי התחלה (כלומר, תא supernatant) ניתן לסנן לפני EV בידוד על ידי משקעים, הפרדת DG, ו ננו-חלקיק העשרה, וכתוצאה מכך הנפח הסופי של ~ 30 μL, המאפשר שימוש מיידי במגוון של במורד הזרם השימוש בהעשרה ננו-?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנחנו רוצים להודות לכל חברי מעבדת Kashanchi, במיוחד גוון קוקס. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) מענקים (AI078859, AI074410, AI127351-01, AI043894, ו NS099029 ל סיר f סאוויני).
Materials
| CEM CD4+ Cells | NIH AIDS Reagent Program | 117 | CEM |
| DPBS without Ca and Mg (1X) | Quality Biological | 114-057-101 | |
| ExoMAX Opti-Enhancer | Systems Biosciences | EXOMAX24A-1 | PEG precipitation reagent |
| Exosome-Depleted FBS | Thermo Fisher Scientific | A2720801 | |
| Fetal Bovine Serum | Peak Serum | PS-FB3 | Serum |
| HIV-1 infected U937 Cells | NIH AIDS Reagent Program | 165 | U1 |
| Nalgene Syringe Filter 0.2 µm SFCA | Thermo Scientific | 723-2520 | |
| Nanotrap (NT80) | Ceres Nanosciences | CN1030 | Reactive Red 120 core |
| Nanotrap (NT82) | Ceres Nanosciences | CN2010 | Cibacron Blue F3GA core |
| Optima XE-980 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma-Aldrich | D1556-250mL | Iodixanol |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Ultra-Clear Tube, 14x89mm | Beckman Coulter | 344059 |
References
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods (San Diego, Calif). 87, 3-10 (2015).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends. BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).
- Momen-Heravi, F., et al. Current methods for the isolation of extracellular vesicles. Biological Chemistry. 394 (10), 1253-1262 (2013).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , (2006).
- Boriachek, K., et al. Biological Functions and Current Advances in Isolation and Detection Strategies for Exosome Nanovesicles. Small (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (6), (2018).
- DeMarino, C., et al. Antiretroviral Drugs Alter the Content of Extracellular Vesicles from HIV-1-Infected Cells. Scientific Reports. 8 (1), 7653 (2018).
- Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Raposo, G., et al. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. The Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).
- Sampey, G. C., et al. Exosomes from HIV-1-infected Cells Stimulate Production of Pro-inflammatory Cytokines through Trans-activating Response (TAR) RNA. The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1251-1266 (2016).
- Ahsan, N. A., et al. Presence of Viral RNA and Proteins in Exosomes from Cellular Clones Resistant to Rift Valley Fever Virus Infection. Frontiers in Microbiology. 7, 139 (2016).
- Barclay, R. A., et al. Exosomes from uninfected cells activate transcription of latent HIV-1. The Journal of Biological Chemistry. 292 (28), 11682-11701 (2017).
- Pleet, M. L., et al. Ebola VP40 in Exosomes Can Cause Immune Cell Dysfunction. Frontiers in Microbiology. 7, 1765 (2016).
- Pleet, M. L., et al. Ebola Virus VP40 Modulates Cell Cycle and Biogenesis of Extracellular Vesicles. The Journal of Infectious Diseases. , (2018).
- Anderson, M. R., et al. Viral antigens detectable in CSF exosomes from patients with retrovirus associated neurologic disease: functional role of exosomes. Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 24 (2018).
- Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochimica Et Biophysica Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
- Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews. Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
- Schwab, A., et al. Extracellular vesicles from infected cells: potential for direct pathogenesis. Frontiers in Microbiology. 6, 1132 (2015).
- Narayanan, A., et al. Exosomes derived from HIV-1-infected cells contain trans-activation response element RNA. The Journal of Biological Chemistry. 288 (27), 20014-20033 (2013).
- Sami Saribas, A., Cicalese, S., Ahooyi, T. M., Khalili, K., Amini, S., Sariyer, I. K. HIV-1 Nef is released in extracellular vesicles derived from astrocytes: evidence for Nef-mediated neurotoxicity. Cell Death & Disease. 8 (1), e2542 (2017).
- Yang, L., et al. Exosomal miR-9 Released from HIV Tat Stimulated Astrocytes Mediates Microglial Migration. Journal of Neuroimmune Pharmacology: The Official Journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 13 (3), 330-344 (2018).
- Arakelyan, A., Fitzgerald, W., Zicari, S., Vanpouille, C., Margolis, L. Extracellular Vesicles Carry HIV Env and Facilitate Hiv Infection of Human Lymphoid Tissue. Scientific Reports. 7 (1), 1695 (2017).
- Jaworski, E., et al. Human T-lymphotropic virus type 1-infected cells secrete exosomes that contain Tax protein. The Journal of Biological Chemistry. 289 (32), 22284-22305 (2014).
- Heinemann, M. L., et al. Benchtop isolation and characterization of functional exosomes by sequential filtration. Journal of Chromatography. A. 1371, 125-135 (2014).
- McNamara, R. P., et al. Large-scale, cross-flow based isolation of highly pure and endocytosis-competent extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1541396 (2018).
- Heinemann, M. L., Vykoukal, J. Sequential Filtration: A Gentle Method for the Isolation of Functional Extracellular Vesicles. Methods in Molecular Biology. 1660, 33-41 (2017).
- Busatto, S., et al. Tangential Flow Filtration for Highly Efficient Concentration of Extracellular Vesicles from Large Volumes of Fluid. Cells. 7 (12), (2018).
- Andriolo, G., et al. Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method. Frontiers in Physiology. 9, 1169 (2018).
- Pleet, M. L., et al. Autophagy, EVs, and Infections: A Perfect Question for a Perfect Time. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 362 (2018).
- Richards, A. L., Jackson, W. T. Intracellular Vesicle Acidification Promotes Maturation of Infectious Poliovirus Particles. PLoS Pathogens. 8 (11), (2012).
- Taylor, M. P., Kirkegaard, K. Modification of Cellular Autophagy Protein LC3 by Poliovirus. Journal of Virology. 81 (22), 12543-12553 (2007).
- Jackson, W. T., et al. Subversion of cellular autophagosomal machinery by RNA viruses. PLoS biology. 3 (5), e156 (2005).
- Suhy, D. A., Giddings, T. H., Kirkegaard, K. Remodeling the Endoplasmic Reticulum by Poliovirus Infection and by Individual Viral Proteins: an Autophagy-Like Origin for Virus-Induced Vesicles. Journal of Virology. 74 (19), 8953-8965 (2000).
