바이러스로부터 멀리 떨어진 고수율 세포 외 소포 제제의 정제

세포외 소포(EV)를 중심으로 한 연구는, 특히 엑소좀, 30-120 nm에 이르는 EV의 일종이며, 3개의 테트라스파닌 마커 CD81, CD9 및 CD63의 존재를 특징으로 하며, 크게 분리하고 관심의 소포를 정화. 다각적 메커니즘을 해부하는 능력은 다양한 내용, 크기 및 다양한 경로를 통해 생성 된 소포의 이기종 집단으로 구성된 샘플을 생성하는 복잡하고 시간이 많이 소요되는 기술로 인해 방해되었습니다. 밀도. 이것은 거의 모든 EV 연구를 위한 문제점이있는 동안, 바이러스 감염의 맥락에서 EV를 공부할 때 특히 중요합니다, virions와 바이러스 같이 입자 (VLPs)는 관심있는 소포에 직경에서 유사할 수 있기 때문에. 예를 들면, 인간 면역 결핍 바이러스 타입-1 (HIV-1)는 대략 100 nm 직경이고, 이는 많은 유형의 EV와 거의 같은 크기입니다. 이러한 이유로 이러한 문제를 해결하기 위해 새로운 EV 격리 워크플로우를 설계했습니다.

EV 절연의 현재 골드 표준은 초원심분리입니다. 이 기술은 다양한 소포 밀도를 사용하여 소포를 각 단계 ^1,2에서저밀도 입자대 고밀도 입자의 차동 침전으로 원심 분리하여 분리 할 수 있게합니다. 몇 가지 저속 원심 분리 단계는 손상되지 않은 세포 (10 분 동안 300-400 x g), 세포 파편 (~ 2,000 x g 10 분), 및 세포 사멸 체 / 대형 소포 (~ 10 분 동안 10 분 동안 10 분)를 제거해야합니다. 이러한 초기 정화는 퇴적 전기 전기에 고속 초원심분리 (100,000-200,000 x g 1.5-2 시간)가 뒤따릅니다. 세척 단계는 EV 순도를 더욱 보장하기 위해 수행되지만, 이로 인해 절연 된 전기 EV의 수가 감소하여 총 수율 ^3,4가감소합니다. 이 방법의 유틸리티는 적절한 결과를 얻기 위해 많은 수의 셀(약 1 x 10⁸⁾및 큰 샘플 부피(> 100 mL)의 요구 사항에 의해 더욱 제한됩니다.

증가하는 우려를 해결하기 위해 친수성 고분자를 사용한 소포의 침전은 최근 몇 년 동안 유용한 기술이 되었습니다. 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 기타 관련 침전 시약은 사용자가 단순히 선택의 시약으로 샘플을 배양하여 샘플 내에서 소포, 바이러스 및 단백질 또는 단백질 RNA 응집체를 당기고 단일 저속으로 당길 수 있게 합니다. 원심 분리^1,2,5. 우리는 이전에 기존의 초원심분리에 비해 전기 를 침전시키는 PEG 또는 관련 방법의 사용이 상당히 높은 수율^6을초래한다는 것을 보고했다. 이 전략은 빠르고 쉽고, 추가 고가의 장비가 필요하지 않으며, 쉽게 확장 가능하며, EV 구조를 유지합니다. 그러나, 이 방법의 난잡한 특성으로 인해, 생성된 샘플은 자유 단백질, 단백질 복합체, 다양한 EV 및 바이리온을 포함한 다양한 제품을 함유하고 있으므로 원하는^집단을 얻기 위해 추가적인 정제가 요구된다 1 ^,2,^7,8.

다양한 강수 방법에서 얻은 전기 EV의 이질성을 극복하기 위해 밀도 그라데이션 초원심분리(DG)는 밀도에 따라 입자를 더 잘 분리하는 데 활용됩니다. 이 방법은 단백질, 단백질 복합체 및 바이러스 또는 바이러스 유사 입자(VLP)로부터 EV를 분리할 수 있는 이오디산놀 또는 수크로오스와 같은 밀도 구배 배지를 사용하여 단계별 구배를 사용하여 수행됩니다. 한때 DG가 EV 하위 모집단을 보다 정밀하게 분리할 수 있다고 생각되었지만 이제는 다양한 소포의 크기와 밀도가 겹칠 수 있다는 사실이 알려져 있습니다. 예를 들어, 엑소좀은 1.08-1.22 g/mL9의 부양 밀도를가지는 것으로 알려져 있으며, 골지(COPI⁺ 또는 클라트린^+)에서분리된 소포는 1.05-1.12 g/mL의 밀도를 가지며 소포성 망막(COPII⁺ ) 1.18-1.25 g /^{mL1,2,3,4,9에서}퇴적물 . 또한, 외형 분획을 바이러스 입자를 포함하는 분획과 비교하려는 경우 관심 바이러스의 밀도에 따라 HIV-1 이외의 바이러스가 동일하게 평형화될 수 있습니다. 외인성 양성 분획과 같은 밀도².

마지막으로, 다운스트림 시각화 및 기능적 검정을 위한 EV 준비의 강화는 EV 연구에 매우 중요합니다. EV 농축 나노 입자, 특히 직경 700-800 nm범위의 다기능 하이드로겔 입자의 사용은 농축 된 EV 준비를 달성하는 데 중요한 단계입니다. 그들은 선택성을 촉진하기 위해 다공성 외부 체질 쉘에 의해 캡슐화 높은 친화력 방향족 미끼를 보유하고 있습니다. 이 연구에서 활용된 나노 입자에는 다양한 시약 및 바이오 유체에서 전기 자동차 포획을 증가시키는 것으로 나타난 다른 코어 미끼(반응성 Red 120 NT80 및 Cibacron Blue F3GA NT82)가 있는 두 가지 뚜렷한 제제가 포함됩니다(재료 표 참조) )^6,10^,11,12,13,^14,15. 입자는 iodixanol 분획, 세포 배양 상급자 뿐만 아니라 플라즈마, 혈청, 뇌 척수액 (CSF) 및 소변^6,13과 같은 환자 생체 유체를 포함한 수많은 시작 물질에서 전기 의 쉽게 농축을 제공합니다 .

여기에 제시된 방법은 여러 기술을 결합하여 현재 EV 정제 기술의 효율성을 향상시킵니다. EV 침전, 밀도 그라데이션 초원심분리 및 입자 캡처를 통해 워크플로우를 간소화하고, 시료 요구 사항을 줄이고, 수율을 증가하여 모든 EV 연구에 사용하기 위해 보다 균일한 EV 샘플을 얻을 수 있습니다. 이 방법은 0.22 μm 여과 단계를 포함하기 때문에 바이러스 감염 시 EV 및 그 내용물을 조사하는 데 특히 유용하며 밀도에 따라 크고 원치 않는 소포 및 VLP를 배제하고 총 EV 집단을 효과적으로 분리하는 단계를 포함합니다. 비리온으로부터 전기를 분리합니다.