Reinigung von hochertragreichen extrazellulären Vesikelpräparaten weg vom Virus

Die Forschung, die sich auf extrazelluläre Vesikel (EVs) konzentriert, insbesondere Exosomen, eine Art von EV im Bereich 30-120 nm und gekennzeichnet durch das Vorhandensein von drei Tetraspanin-Markern CD81, CD9 und CD63, wurde weitgehend durch die Entwicklung von Methoden zur Isolierung und die Vesikel von Interesse zu reinigen. Die Fähigkeit, vielfältige Mechanismen zu dissektieren, wurde durch komplexe und zeitaufwändige Techniken behindert, die Proben erzeugen, die aus einer heterogenen Population von Vesikeln bestehen, die über verschiedene Wege mit einer Vielzahl von Inhalten, Größen und Dichten. Während dies ein Problem für fast die gesamte EV-Forschung ist, ist es von besonderer Bedeutung bei der Untersuchung von Elektrofahrzeugen im Zusammenhang mit Virusinfektionen, da Virionen und virusähnliche Partikel (VLPs) im Durchmesser den Vesikeln von Interesse ähnlich sein können. Zum Beispiel hat das Human Immunodeficiency Virus Typ 1 (HIV-1) einen Durchmesser von etwa 100 nm, was ungefähr der Größe vieler Arten von Elektrofahrzeugen entspricht. Aus diesem Grund haben wir einen neuartigen EV-Isolations-Workflow entwickelt, um diese Probleme anzugehen.

Der aktuelle Goldstandard der EV-Isolierung ist die Ultrazentrifugation. Diese Technik nutzt die verschiedenen Vesikeldichten, die es ermöglichen, die Vesikel durch Zentrifugation mit Differentialsedimentation von Partikeln mit höherer Dichte im Vergleich zu Partikeln mit niedrigerer Dichte in jeder Stufe ^1,2zu trennen. Mehrere Mittel zur Zentrifugierung mit niedriger Geschwindigkeit sind erforderlich, um intakte Zellen (300-400 x g für 10 min), Zellablagerungen (für 10 min) und apoptotische Körper/große Vesikel (10.000 x g für 10 min) zu entfernen. Auf diese anfänglichen Reinigungen folgt eine Hochgeschwindigkeits-Ultrazentrifugation (100.000-200.000 x g für 1,5-2 h) zu Sediment-EVs. Waschschritte werden durchgeführt, um die Reinheit der Evev weiter zu gewährleisten, dies führt jedoch zur Verringerung der Anzahl isolierter Elektrofahrzeuge, wodurch die Gesamtausbeute ^3,4verringert wird. Der Nutzen dieser Methode wird durch den Bedarf an einer großen Anzahl von Zellen (ca. 1 x 10⁸) und einem großen Probenvolumen (> 100 ml) weiter eingeschränkt, um angemessene Ergebnisse zu erzielen.

Um den wachsenden Bedenken Rechnung zu tragen, ist die Fällung von Vesikeln mit hydrophilen Polymeren in den letzten Jahren zu einer nützlichen Technik geworden. Polyethylenglykol (PEG) oder andere verwandte Niederschlagsreagenzien ermöglichen es dem Anwender, die Vesikel, Viren und Protein- oder Protein-RNA-Aggregate innerhalb einer Probe herunterzuziehen, indem die Probe einfach mit dem Reagenz der Wahl inkubiert wird, gefolgt von einer einzigen Zentrifugation^1,2,5. Wir haben bereits berichtet, dass die Verwendung von PEG oder verwandten Methoden zur Ausscheidung von Elektrofahrzeugen im Vergleich zur herkömmlichen Ultrazentrifugation zu einer deutlich höheren Ausbeute⁶führt. Diese Strategie ist schnell, einfach, erfordert keine zusätzliche teure Ausrüstung, ist leicht skalierbar und behält die EV-Struktur bei. Aufgrund des promiskuitiven Charakters dieser Methode enthalten die resultierenden Proben jedoch eine Vielzahl von Produkten, darunter freie Proteine, Proteinkomplexe, eine Reihe von Elektrofahrzeugen und Virionen, die eine weitere Reinigung erfordern, um die gewünschte Population zu erhalten^{1 ,2,7,8}.

Um die Heterogenität von Elektrofahrzeugen zu überwinden, die aus verschiedenen Niederschlagsmethoden gewonnen werden, wird die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation (DG) genutzt, um Partikel auf der Grundlage ihrer Dichte besser zu trennen. Diese Methode wird mit einem stufenweisen Gradienten unter Verwendung eines Dichtegradientenmediums wie Iodixanol oder Saccharose durchgeführt, das die Trennung von Elektrofahrzeugen von Proteinen, Proteinkomplexen und virus- oder virusähnlichen Partikeln (VLPs) ermöglicht. Es ist wichtig zu beachten, dass, obwohl man einst dachte, dass die DG eine genauere Trennung der EV-Subpopulationen zulässt, es heute bekannt ist, dass sich Größen und Dichten verschiedener Vesikel überschneiden können. So haben Exosomen bekanntermaßen Flotationsdichten von 1,08-1,22 g/ml⁹, während aus dem Golgi isolierte Vesikel (COPI⁺ oder Clathrin⁺) Dichten von 1,05-1,12 g/ml und solche aus dem endoplasmatischen Retikulum (COPII⁺ ) Sediment bei 1,18-1,25 g/mL^1,2,3,4,9. Wenn man exosomale Fraktionen mit Fraktionen vergleichen möchte, die Viruspartikel enthalten, kann dies je nach Dichte des Virus von Interesse schwieriger werden – es gibt andere Viren als HIV-1, die wahrscheinlich gleichzeitig ausgleichen. Dichte als exosomale positive Fraktionen².

Schließlich ist die Anreicherung von EV-Preps für nachgelagerte Visualisierungen und funktionelle Assays für die EV-Forschung von entscheidender Bedeutung. Die Verwendung von EV-anreichernden Nanopartikeln, insbesondere multifunktionalen Hydrogelpartikeln mit einem Durchmesser von 700-800 nm, ist ein entscheidender Schritt zur Erreichung konzentrierter EV-Preps. Sie besitzen einen aromatischen Köder mit hoher Affinität, der von einer porösen äußeren Siebschale gekapselt wird, um die Selektivität zu fördern. Zu den in dieser Studie verwendeten Nanopartikeln gehören zwei unterschiedliche Präparate mit unterschiedlichen Kernködern (Reactive Red 120 NT80 und Cibacron Blue F3GA NT82), die nachweislich die Erfassung von Elektrofahrzeugen aus verschiedenen Reagenzien und Biofluiden erhöhen (siehe Tabelle der Materialien). )^{6,10,11,12,13,14,15}. Die Partikel bieten eine einfache Anreicherung von Elektrofahrzeugen aus zahlreichen Ausgangsmaterialien, darunter Iodixanolfraktionen, Zellkulturüberstand, sowie Patientenbiofluide wie Plasma, Serum, zerebrale Rückenmarksflüssigkeiten (CSF) und Urin^6,13 .

Die hier vorgestellte Methode verbessert die Effizienz der aktuellen EV-Reinigungstechniken durch die Kombination mehrerer Technologien; EV-Fällung, Dichtegradienten-Ultrazentrifugation und Partikelerfassung, um den Workflow zu optimieren, die Probenanforderungen zu reduzieren und die Ausbeute zu erhöhen, um eine homogenere EV-Probe für den Einsatz in allen EV-Forschungen zu erhalten. Diese Methode ist besonders nützlich bei der Untersuchung von Elektrofahrzeugen und deren Inhalt während einer Virusinfektion, da sie einen Filterschritt von 0,22 m umfasst, um große, unerwünschte Vesikel und VLPs sowie die Trennung der gesamten EV-Population auf der Grundlage der Dichte zu einer effektiven EVs von Virions zu isolieren.