Zuivering van extracellulaire vesikel preparaten met hoge opbrengst uit de buurt van het virus

Onderzoek gecentreerd rond extracellulaire blaasjes (Ev’s), in het bijzonder exosomen, een type EV variërend van 30-120 nm en gekenmerkt door de aanwezigheid van drie tetraspanin markers CD81, CD9 en CD63, is grotendeels gevormd door de ontwikkeling van methoden om te isoleren en Reinig de blaasjes van belang. De mogelijkheid om veelzijdige mechanismen te ontleden is belemmerd vanwege complexe en tijdrovende technieken die monsters genereren die bestaan uit een heterogene populatie van blaasjes die via verschillende trajecten worden gegenereerd met een breed scala aan inhoud, maten en Dichtheden. Hoewel dit een probleem is voor bijna alle EV-onderzoek, is het van bijzonder belang bij het bestuderen van EVS in de context van virale infectie, omdat virionen en virusachtige deeltjes (vlp’s) vergelijkbaar in diameter kunnen zijn voor de blaasjes van belang. Zo is het humaan immunodeficiëntie virus type 1 (HIV-1) ongeveer 100 nm in diameter, wat ongeveer even groot is als vele soorten Ev’s. Om deze reden hebben we een nieuwe EV-isolatie workflow ontworpen om deze problemen aan te pakken.

De huidige gouden standaard van EV-isolatie is ultracentrifugatie. Deze techniek maakt gebruik van de verschillende blaasje dichtheden, waardoor de blaasjes kunnen worden gescheiden door centrifugeren met differentiële sedimentatie van hogere dichtheids deeltjes versus lagere dichtheids deeltjes in elke fase ^1,2. Er zijn verschillende stappen voor het centrifugeren van lage snelheid vereist om intacte cellen te verwijderen (300-400 x g gedurende 10 min), celresten (~ 2.000 x g gedurende 10 min) en apoptotische lichamen/grote blaasjes (~ 10.000 x g gedurende 10 min). Deze initiële zuiveringen worden gevolgd door ultrasnelle ultracentrifugatie (100000-200000 x g voor 1.5-2 h) aan sediment EVS. Wasstappen worden uitgevoerd om de zuiverheid van de EV verder te waarborgen, maar dit resulteert in de vermindering van het aantal geïsoleerde ev’s, waardoor de totale opbrengst ^3,4wordt verlaagd. Het nut van deze methode wordt verder beperkt door de eis van een groot aantal cellen (ongeveer 1 x 10⁸) en een groot monstervolume (≫ 100 ml) om adequate resultaten te bereiken.

Om de toenemende bezorgdheid aan te pakken, is het neerslaan van blaasjes met hydrofiele polymeren de laatste jaren een nuttige techniek geworden. Polyethyleenglycol (PEG), of andere verwante precipitatie reagentia, stelt de gebruiker in staat om de vesicles, virussen en eiwitten-of proteïne-RNA-aggregaten binnen een monster te trekken door simpelweg het monster met het reagens naar keuze te inbroed, gevolgd door een enkele lage-snelheid centrifugeren^1,2,5. We hebben eerder gemeld dat het gebruik van PEG of gerelateerde methoden om EVs te precipderen in vergelijking met traditionele ultracentrifugatie resulteert in een significant hogere opbrengst⁶. Deze strategie is snel, eenvoudig, vereist geen extra dure apparatuur, is gemakkelijk schaalbaar en behoudt de EV-structuur. Vanwege de promiscue aard van deze methode bevatten de resulterende monsters een verscheidenheid aan producten, waaronder vrije eiwitten, eiwitcomplexen, een reeks Ev’s en virionen, waardoor verdere zuivering nodig is om de gewenste populatie te verkrijgen^{1 ,2,7,8}.

Om de heterogeniteit van de uit verschillende neerslag methoden verkregen EVs te overwinnen, wordt dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie (DG) gebruikt om deeltjes beter te scheiden op basis van hun dichtheid. Deze methode wordt uitgevoerd met behulp van een stapsgewijze helling met behulp van een dichtheidsgradiënt medium, zoals iodixanol of sucrose, die de scheiding van EVs van eiwitten, eiwitcomplexen en virus-of virusachtige deeltjes (Vlp’s) mogelijk maakt. Het is belangrijk op te merken dat, hoewel er ooit werd gedacht dat DG een preciezere scheiding van EV-subpopulaties toeliet, het nu bekend is dat maten en dichtheden van verschillende blaasjes elkaar kunnen overlappen. Exosomen zijn bijvoorbeeld gekend om flotatie dichtheden van 1,08-1.22 g/ml⁹te hebben, terwijl blaasjes geïsoleerd van de Golgi (Copi⁺ of clathrin⁺) een dichtheden van 1.05-1.12 g/ml en die van het endoplasmische reticulum (copii⁺ ) sediment bij 1,18-1,25 g/ml^1,2,3,4,9. Bovendien, indien men exosomale fracties wil vergelijken tegen fracties die virale deeltjes bevatten, kan dit, afhankelijk van de dichtheid van het virus van belang, moeilijker worden — er zijn andere virussen dan HIV-1 die waarschijnlijk op hetzelfde dichtheden als exosomale positieve fracties².

Tot slot is de verrijking van EV-Preps voor downstreamvisualisatie en functionele assays van vitaal belang voor EV-onderzoek. Het gebruik van EV-verrijkende nanodeeltjes, met name multi-functionele hydrogelpartikels met een diameter van 700-800 nm, is een cruciale stap in het bereiken van geconcentreerde EV-Preps. Ze bezitten een aromatische aas met een hoge affiniteit die is ingekapseld door een poreuze buitenste zeef schaal om selectiviteit te bevorderen. De nanodeeltjes die in deze studie worden gebruikt, omvatten twee verschillende preparaten met verschillende kern loten (reactieve rode 120 NT80; en Cibacron blauw F3GA NT82) die hebben aangetoond dat de inname van EVs uit verschillende reagentia en biovloeistoffen toeneemt (Zie de tabel met materialen )^{6,10,11,12,13,14,15}. De deeltjes bieden een eenvoudige verrijking van EVS uit talrijke uitgangsmaterialen, waaronder iodixanol-fracties, supernatant van de celcultuur, evenals biovloeistoffen van patiënten zoals plasma, serum, cerebrale spinale vloeistoffen (CSF) en urine^6,13 .

De hier gepresenteerde methode verbetert de efficiëntie van de huidige EV-zuiverings technieken door verschillende technologieën te combineren; EV neerslag, dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie, en deeltjes opname, om de workflow te stroomlijnen, monster vereisten te verminderen en de opbrengst te verhogen om een meer homogene EV-sample te verkrijgen voor gebruik in alle EV-onderzoek. Deze methode is met name nuttig bij het onderzoek naar EVs en de inhoud ervan tijdens virale infectie, omdat het een filtratie stap van 0,22 μm bevat om grote, ongewenste blaasjes en Vlp’s uit te sluiten en de totale EV-populatie te scheiden op basis van dichtheid om effectief Isoleer EVs uit virionen.