Purificazione dei preparati vescicoli extracellulari ad alto rendimento lontano dal virus

La ricerca incentrata sulle vescicle extracellulari (EV), in particolare gli esosomi, un tipo di Veicoli che vanno 30-120 nm e caratterizzato dalla presenza di tre marcatori tetraspanina CD81, CD9 e CD63, è stato in gran parte modellato dallo sviluppo di metodi per isolare e purificare le vesciche di interesse. La capacità di sezionare meccanismi sfaccettati è stata ostacolata a causa di tecniche complesse e dispendiose in termini di tempo che generano campioni composti da una popolazione eterogenea di vescicoli generati attraverso percorsi diversi con una vasta gamma di contenuti, dimensioni e Densità. Anche se questo è un problema per quasi tutte le ricerche EV, è di particolare importanza quando si studiano i vesc nel contesto dell’infezione virale, poiché i virioni e le particelle simili a virus (VLP) possono avere un diametro simile a quello delle vesciche di interesse. Ad esempio, il virus dell’immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1) ha un diametro di circa 100 nm, che ha all’incirca le stesse dimensioni di molti tipi di veicoli elettrici. Per questo motivo, abbiamo progettato un nuovo flusso di lavoro di isolamento EV per risolvere questi problemi.

L’attuale gold standard di isolamento EV è l’ultracentrifugazione. Questa tecnica si avvale delle varie densità vescicolari, che permettono alle vescicoli di essere separate dalla centrifugazione differenziale con sedimentazione differenziale di particelle ad alta densità rispetto a particelle a densità inferiore in ogni fase ^1,2. Sono necessari diversi gradini di centrifugazione a bassa velocità per rimuovere le cellule intatte (300-400 x g per 10 min), i detriti cellulari (2.000 x g per 10 minuti) e i corpi apoptotici e le grandi vesciche (10.000 x g per 10 min). Queste purificazioni iniziali sono seguite da ultracentrifugazione ad alta velocità (100,000-200,000 x g per 1,5-2 h) per sedimentare EV. Vengono eseguite fasi di lavaggio per garantire ulteriormente la purezza dei veicoli elettrici, tuttavia, ciò comporta la riduzione del numero di VE isolate, riducendo così la resa totale ^3,4. L’utilità di questo metodo è ulteriormente limitata dal requisito di un gran numero di celle (circa 1 x 10⁸) e un grande volume di campionamento (> 100 mL) per ottenere risultati adeguati.

Per affrontare le crescenti preoccupazioni, la precipitazione delle vescicole con polimeri idrofili è diventata una tecnica utile negli ultimi anni. Il glicole in polietilene (PEG), o altri reagenti di precipitazioni correlati, consente all’utente di abbattere le vescicole, i virus e gli aggregati proteina o proteina-RNA all’interno di un campione semplicemente incubando il campione con il reagente di scelta, seguito da un singolo centrifugazione^1,2,5. Abbiamo già riferito che l’uso di PEG o metodi correlati per precipitare EV rispetto ai tradizionali risultati di ultracentrifugazione in un rendimento significativamente più alto⁶. Questa strategia è veloce, facile, non richiede ulteriori attrezzature costose, è prontamente scalabile e mantiene la struttura EV. Tuttavia, a causa della natura promiscua di questo metodo, i campioni risultanti contengono una varietà di prodotti tra cui proteine libere, complessi proteici, una gamma di EV e virioni che richiedono quindi un’ulteriore purificazione per ottenere la popolazione desiderata^{1 ,2,7,8}.

Per superare l’eterogeneità dei VE ottenuti da vari metodi di precipitazione, l’ultracentrifugazione del gradiente di densità (DG) viene utilizzata per separare meglio le particelle in base alla loro densità. Questo metodo viene eseguito utilizzando un gradiente stepwise utilizzando un mezzo di gradiente di densità, come iodixanol o saccarosio, che consente la separazione degli EV da proteine, complessi proteici e particelle di virus o virus (VLP). È importante notare che, mentre una volta si pensava che la DG consentisse una separazione più precisa delle sottopopolazioni EV, è ormai noto che le dimensioni e le densità delle varie vesciche possono sovrapporsi. Ad esempio, gli esosomi sono noti per avere densità di galleggiamento di 1,08-1,22 g/mL⁹, mentre le vescicole isolate dal Golgi (COPI ) hanno densità di 1,05-1,12 g/mL e quelle del reticulum endoplasmico (COPII) hanno densità di 1,05-1,12 g/mL e quelle del reticulum degli endoplasmici (COPII) hanno densità di 1,05-1,12 g/mL e quelle del reticolo endoplasmico (COPII) hanno densità di 1,05-1,12 g/mL e quelle del reticolo endoplasmico (COPII) hanno densità di 1,05-1,12 g/mL e quelle del reticolo endoplasmico (COPII) hanno densità di 1,05-1,12 g/mL e quelle del reticolo endoplasmico (COPII) ) sedimento a 1,18-1,25 g/mL^1,2,3,4,9. Inoltre, se si desidera confrontare le frazioni esosomiche con le frazioni contenenti particelle virali, questo può diventare più difficile a seconda della densità del virus di interesse, ci sono virus diversi dall’HIV-1 che probabilmente equilibrato allo stesso densità come frazioni positive esosomiche².

Infine, l’arricchimento dei presupposti EV per la visualizzazione a valle e i saggi funzionali è fondamentale per la ricerca EV. L’uso di nanoparticelle che arricchiscono EV, in particolare, particelle di idrogel multifunzionali di 700-800 nm di diametro, sono un passo fondamentale per raggiungere prep EV concentrate. Possiedono un’esca aromatica ad alta affinità che incapsulata da un guscio di setaccio esterno poroso per promuovere la selettività. Le nanoparticelle utilizzate in questo studio includono due distinti preparati con esche di base diverse (Reactive Red 120 NT80; e Cibacron Blue F3GA NT82) che hanno dimostrato di aumentare la cattura dei veli da vari reagenti e biofluidi (vedi la Tabella dei Materiali )^{6,10,11,12,13,14,15}. Le particelle offrono un facile arricchimento degli EV da numerosi materiali di partenza, tra cui frazioni di iodixanolo, colture cellulari supernatali, nonché biofluidi pazienti come plasma, siero, fluidi spinali cerebrali (CSF) e urina^6,13 .

Il metodo qui presentato migliora l’efficienza delle attuali tecniche di purificazione dei videoimpres con diverse tecnologie; Precipitazione EV, ultracentrifugazione del gradiente di densità e cattura di particelle, per semplificare il flusso di lavoro, ridurre i requisiti di campionamento e aumentare la resa per ottenere un campione EV più omogeneo da utilizzare in tutte le ricerche EV. Questo metodo è particolarmente utile nello studio dei veicoli elettrici e del loro contenuto durante l’infezione virale in quanto include un passaggio di filtrazione di 0,22 m per escludere le vesciche e i VLP di grandi dimensioni e indesiderati e la separazione della popolazione totale di Veicoli leggeri in base alla densità per isolare i veicoli elettrici dai virioni.