Summary

Purificazione di una proteina di massa molecolare elevata in Streptococcus mutans

Published: September 14, 2019
doi:

Summary

Descritto qui è un metodo semplice per la purificazione di un prodotto genetico in Streptococcus mutans. Questa tecnica può essere vantaggiosa nella purificazione delle proteine, in particolare le proteine della membrana e le proteine ad alta massa molecolare, e può essere utilizzata con varie altre specie batteriche.

Abstract

La chiarificazione della funzione di un gene comporta in genere il confronto dei tratti fenotipici dei ceppi e dei ceppi di tipo selvaggio in cui il gene di interesse è stato interrotto. La perdita di funzione dopo l’interruzione genica viene successivamente ripristinata mediante l’aggiunta esogena del prodotto del gene interrotto. Questo aiuta a determinare la funzione del gene. Un metodo descritto in precedenza comporta la generazione di un ceppo Streptococcus mutans interrotto dal gene gtfC. Qui, viene descritto un metodo poco impegnativo per purificare il prodotto genico gtfC dal ceppo S. mutans appena generato dopo la rottura genica. Si tratta dell’aggiunta di una sequenza di codifica della polihistidina alla fine del gene di interesse, che consente una semplice purificazione del prodotto genetico utilizzando la cromatografia dell’affinità metallica immobilizzata. Non sono necessarie reazioni enzimatiche diverse da PCR per la modificazione genetica in questo metodo. Il ripristino del prodotto genetico mediante aggiunta esogena dopo la perturbazione genica è un metodo efficace per determinare la funzione genica, che può anche essere adattata a diverse specie.

Introduction

L’analisi della funzione di un gene di solito comporta il confronto dei tratti fenotipici dei ceppi di tipo selvaggio ai ceppi in cui il gene di interesse è stato interrotto. Una volta prodotto il ceppo dirompente genico, l’aggiunta esogena del prodotto genetico consente il ripristino funzionale.

Il metodo più comune per ottenere i prodotti genici purificati necessari per il successivo restauro è eseguendo un’espressione eterologa in Escherichia coli1. Tuttavia, l’espressione di proteine della membrana o di proteine di massa molecolari elevate è spesso difficile da usare in questo sistema1. In questi casi, la proteina bersaglio è solitamente isolata dalle cellule che sintetizzano nativamente la proteina attraverso una complessa serie di passaggi, che possono portare alla perdita del prodotto genetico. Per superare questi problemi, è stata sviluppata una semplice procedura per la purificazione del prodotto genico a seguito di un metodo di interruzione genica2, del metodo di giunzione del DNA basato su PCR3 (PCR di fusione in due fasi) e dell’elettroporazione per la genetica trasformazione in Streptococcus mutans. L’aggiunta di un tag polihisinoso (His-tag) al capo-terminus del prodotto genetico ne facilita la purificazione mediante cromatografia di affinità metallica immobilizzata (IMAC).

Per isolare il ceppo che esprime tag His, l’intero DNA genomico del gene di interesse (in questo ceppo disgregazione genica che esprime i suoi tag) viene sostituito da un gene marcatore resistente agli antibiotici. La procedura per generare la varietà His-tag-expressing è quasi identica a quella per generare un ceppo genico-interrotto come descritto in precedenza4,5. Pertanto, i metodi per la perturbazione genica e l’isolamento del prodotto genico dovrebbero essere eseguiti come esperimenti seriali per l’analisi funzionale.

Nel lavoro attuale, una sequenza di codifica della polihisina è collegata al gene gtfC (GenBank locus tag SMU_1005), codificando glucosyltransferase-SI (GTF-SI) in S. mutans6. Quindi, sono stati eseguiti studi di espressione in una specie streptococcale. Raggiungere l’espressione eteologa di gtfC da parte di E. coli è difficile, probabilmente a causa dell’alta massa molecolare di GTF-SI. Questo ceppo si chiama S. mutans His-gtfC. Un’illustrazione schematica raffigurante l’organizzazione della cassetta del gene gtfC e della spettromica (spcr)7 loci in Wild-type S. mutans (S. mutans WT) e i suoi derivati è mostrato in Figura 1. Il GTF-SI è una proteina secretoria che contribuisce allo sviluppo del biofilm dentale cariogenico6. Sotto la presenza di saccarosio, un biofilm aderente è osservato su una superficie di vetro liscia in WT S. mutans ceppo ma non nella deformazione S. mutans gtfC-interrotto (S. mutansgtfC)2,5 . La formazione di biofilm viene ripristinata in S. mutans gt –fC dopo l’aggiunta esogena del ricombinante GTF-SI. Il ceppo, S. mutans His-gtfC, viene quindi utilizzato per produrre il ricombinante GTF-SI.

Protocol

NOT:</ Generazione di S. mutans -gtfC, in cui l’intera area di codifica del gene gtfC viene sostituita con spcr, deve essere completata prima di eseguire questi protocolli. Fare riferimento all’articolo pubblicato per informazioni dettagliate sulla generazione5. 1. Progettazione di Primer Preparare primer per la costruzione di S. mutans His-gtfC.<stron…

Representative Results

Figura 3 Mostra la dimensione di ogni amplificatore dal primo PCR (Figura 3A) e secondo PCR (Figura 3B). La dimensione di ogni amplificatore corrispondeva alla dimensione prevista, come descritto nella Tabella 1. La figura 4A mostra le colonie di S. mutans trasformate con il secondo prodotto PCR e placcate sulle piastre di agar BHI contenenti sp…

Discussion

La progettazione dei primer è il passo più critico del protocollo. Le sequenze dei primer gtfC-reverse e spcr-forward sono state determinate automaticamente in base alle sequenze sia della regione finale 3 di gtfC che della regione finale 5 di spcr. Ogni primer include 24 basi complementari che codificano un linker GS e una sequenza His-tag-coding nelle loro regioni 5′. L’interruzione delle sequenze normative native situate nelle regioni di fianco a monte può e…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato dalla Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (numeri di sovvenzione 16K15860 e 19K10471 a T. M., da 17K12032 a M. I., e da 18K09926 a N. H.) e dalla SECOM Science and Technology Foundation (SECOM) (numero di sovvenzione 2018.09.10 n. 10).

Materials

Agarose Nippon Genetics NE-AG02 For agarose gel electrophoresis
Anaeropack Mitsubishi Gas Chemical A-03 Anaerobic culture system
Anti-His-Tag monoclonal antibody MBL D291-7 HRP-conjugated
BCA protein assay kit Thermo Fisher Scientific 23227 Measurement of protein concentration
Brain heart infusion broth Becton, Dickinson 237500 Bacterial culture medium
CBB R-250 Wako 031-17922 For biofilm staining
Centrifugal ultrafiltration unit Sartorius VS2032 Buffer replacement and protein concentration
Centrifuge Kubota 7780II
Chromatographic column Bio-Rad 7321010 For IMAC
Dialysis membrane clamp Fisher brand 21-153-100
Dialysis tubing As One 2-316-06
DNA polymerase Takara R045A High-fidelity DNA polymerase
DNA sequencing Eurofins Genomics
ECL substrate Bio-Rad 170-5060 For western blotting
EDTA (0.5 M pH 8.0) Wako 311-90075 Tris-EDTA buffer preparation
Electroporation cuvette Bio-Rad 1652086 0.2 cm gap
Electroporator Bio-Rad 1652100
EtBr solution Nippon Gene 315-90051 For agarose gel electrophoresis
Gel band cutter Nippon Genetics FG-830
Gel extraction kit Nippon Genetics FG-91202 DNA extraction from agarose gel
Imager GE Healthcare 29083461 For SDS-PAGE and western blotting
Imidazole Wako 095-00015 Binding buffer and elution buffer preparation
Incubator Nippon Medical & Chemical Instruments EZ-022 Temperature setting: 4 °C
Incubator Nippon Medical & Chemical Instruments LH-100-RDS Temperature setting: 37 °C
Membrane filter Merck Millipore JGWP04700 0.2 µm diameter
Microcentrifuge Kubota 3740
NaCl Wako 191-01665 Preparation of binding buffer and elution buffer
NaH2PO4·2H2O Wako 192-02815 Preparation of binding buffer and elution buffer
NaOH Wako 198-13765 Preparation of binding buffer and elution buffer
(NH4)2SO4 Wako 015-06737 Ammonium sulfate precipitation
Ni-charged resin Bio-Rad 1560133 For IMAC
PCR primers Eurofins Genomics Custom-ordered
Protein standard Bio-Rad 161-0381 For SDS-PAGE and western blotting
Solvent filtration apparatus As One FH-1G
Spectinomycin Wako 195-11531 Antibiotics; use at 100 μg/mL
Sterile syringe filter Merckmillipore SLGV004SL 0.22 µm diameter
Streptococus mutans ΔgtfC Stock strain in the lab. gtfC replaced with spcr
Streptococus mutans UA159 Stock strain in the lab. S. mutans ATCC 700610, Wild-type strain
Sucrose Wako 196-00015 For biofilm development
TAE (50 × ) Nippon Gene 313-90035 For agarose gel electrophoresis
Thermal cycler Bio-Rad PTC-200
Tris-HCl (1 M, pH 8.0) Wako 314-90065 Tris-EDTA buffer preparation

References

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Citer Cet Article
Murata, T., Yamashita, M., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans. J. Vis. Exp. (151), e59804, doi:10.3791/59804 (2019).

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