Purificação de uma proteína de massa molecular elevada em Streptococcus mutans
Summary
Descrito aqui é um método simples para a purificação de um produto genético em Streptococcus mutans. Esta técnica pode ser vantajosa na purificação de proteínas, especialmente proteínas de membrana e proteínas de massa molecular elevada, podendo ser utilizada com várias outras espécies bacterianas.
Abstract
O elucidation da função de um gene envolve tipicamente a comparação de traços fenotípicos de estirpes e de tensões do selvagem-tipo em que o gene do interesse foi interrompido. A perda da função que segue o rompimento do gene é restaurada subseqüentemente pela adição exógena do produto do gene interrompido. Isso ajuda a determinar a função do gene. Um método descrito anteriormente envolve a geração de uma cepa de Streptococcus mutans com ruptura de gene gtfc . Aqui, um método não exigente é descrito para purificar o produto do gene Gtfc da estirpe de S. mutans recém-gerada após o rompimento do gene. Envolve a adição de uma seqüência da polyhistidine-Coding na extremidade 3 do ′ do gene do interesse, que permite a purificação simples do produto do gene usando a cromatografia de afinidade imobilizada do metal. Não são necessárias reações enzimáticas para além da PCR para a modificação genética neste método. A restauração do produto genético por adição exógena após o rompimento genético é um método eficiente para determinar a função gênica, que também pode ser adaptada a diferentes espécies.
Introduction
A análise de um gene ‘ a função de s envolve geralmente a comparação de traços fenotípicos de estirpes do selvagem-tipo às tensões em que o gene do interesse foi interrompido. Uma vez que a estirpe de gene-disrupted é produzida, a adição exógena do produto do gene permite a restauração funcional.
O método mais comum para a obtenção de produtos gênicos purificados necessários para os ensaios subsequentes de restauração é a realização de expressão heteróloga em Escherichia coli1. No entanto, a expressão de proteínas de membrana ou proteínas de alta massa molecular é muitas vezes difícil usando este sistema1. Nestes casos, a proteína alvo é geralmente isolada das células que sintetiza nativamente a proteína através de uma série complexa de etapas, o que pode levar à perda do produto genético. Para superar estas edições, um procedimento simples foi desenvolvido para a purificação do produto do gene que segue um método2do rompimento do gene, método de emenda PCR-baseado do ADN3 (PCR designado da fusão da dois-etapa), e Electroporation para genético transformação em Streptococcus mutans. A adição de uma etiqueta do polyhistidine (His-tag) ao C-Terminus do produto do gene facilita sua purificação pela cromatografia de afinidade imobilizada do metal (IMAC).
Para isolar a estirpe his-tag-expressando, o ADN genomic inteiro do gene do interesse (neste seu-Tag-expressando a tensão gene-disrupted) é substituído com um gene antibiótico-resistente do marcador. O procedimento para gerar o seu-Tag-expressando strainis quase idêntico àquele para gerar uma tensão gene-interrompida como descrita previamente4,5. Conseqüentemente, os métodos para o rompimento do gene e o isolamento do produto do gene devem ser executados como experimentos seriais para a análise funcional.
No presente trabalho, uma seqüência de codificação de polihistidina é anexada à extremidade 3 ′ do gene Gtfc (GenBank Locus tag SMU_1005), codificando glucosyltransferase-si (GTF-si) em S. mutans6. Em seguida, foram realizados estudos de expressão em espécie estreptocócica. Conseguir a expressão heterólogo de gtfc por E. coli é difícil, provável por causa da massa molecular elevada de GTF-si. Esta estirpe chama-se S. mutans his-gtfc. Uma ilustração esquemática que descreve a organização da gaveta do gene da resistência de gtfc e de espectinomicina (SPCr)7 loci em Wild-Type s. mutans (s. mutans WT) e seus derivados é mostrado em Figura 1. O GTF-SI é uma proteína secretora que contribui para o desenvolvimento do biofilme dental cariogênico6. a presença de sacarose, um biofilme aderente é observado em uma superfície de vidro liso na estirpe de WT s. mutans , mas não na estirpe de s. mutans gtfc-disrupted (s. mutans Δgtfc)2,5 . A formação de biofilme é restaurada em S. mutans Δgtfc após adição exógena do GTF-si recombinante. A cepa, S. mutans his-gtfc, é então usada para produzir o GTF-si recombinante.
Protocol
Representative Results
Discussion
O projeto de primers é o passo mais crítico do protocolo. As sequências dos primers gtfc-Reverse e SPCr-Forward foram automaticamente determinadas com base nas sequências da região final de 3 ′ do gtfc e da região final de 5 ′ do SPCr. Cada primer inclui 24 bases complementares que codificam um vinculador GS e uma sequência de codificação his-tag em suas 5 ‘ regiões. O rompimento das seqüências reguladoras nativas situadas nas regiões flanqueando …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela sociedade japonesa para a promoção da ciência (JSPS) (números de subvenção 16K15860 e 19K10471 para T. M., 17K12032 a M. I., e 18K09926 a N. H.) e a Fundação de ciência e tecnologia da SECOM (SECOM) (número de subvenção 2018.09.10 n º 1).
Materials
| Agarose | Nippon Genetics | NE-AG02 | For agarose gel electrophoresis |
| Anaeropack | Mitsubishi Gas Chemical | A-03 | Anaerobic culture system |
| Anti-His-Tag monoclonal antibody | MBL | D291-7 | HRP-conjugated |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Measurement of protein concentration |
| Brain heart infusion broth | Becton, Dickinson | 237500 | Bacterial culture medium |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | For biofilm staining |
| Centrifugal ultrafiltration unit | Sartorius | VS2032 | Buffer replacement and protein concentration |
| Centrifuge | Kubota | 7780II | |
| Chromatographic column | Bio-Rad | 7321010 | For IMAC |
| Dialysis membrane clamp | Fisher brand | 21-153-100 | |
| Dialysis tubing | As One | 2-316-06 | |
| DNA polymerase | Takara | R045A | High-fidelity DNA polymerase |
| DNA sequencing | Eurofins Genomics | ||
| ECL substrate | Bio-Rad | 170-5060 | For western blotting |
| EDTA (0.5 M pH 8.0) | Wako | 311-90075 | Tris-EDTA buffer preparation |
| Electroporation cuvette | Bio-Rad | 1652086 | 0.2 cm gap |
| Electroporator | Bio-Rad | 1652100 | |
| EtBr solution | Nippon Gene | 315-90051 | For agarose gel electrophoresis |
| Gel band cutter | Nippon Genetics | FG-830 | |
| Gel extraction kit | Nippon Genetics | FG-91202 | DNA extraction from agarose gel |
| Imager | GE Healthcare | 29083461 | For SDS-PAGE and western blotting |
| Imidazole | Wako | 095-00015 | Binding buffer and elution buffer preparation |
| Incubator | Nippon Medical & Chemical Instruments | EZ-022 | Temperature setting: 4 °C |
| Incubator | Nippon Medical & Chemical Instruments | LH-100-RDS | Temperature setting: 37 °C |
| Membrane filter | Merck Millipore | JGWP04700 | 0.2 µm diameter |
| Microcentrifuge | Kubota | 3740 | |
| NaCl | Wako | 191-01665 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| NaH2PO4·2H2O | Wako | 192-02815 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| NaOH | Wako | 198-13765 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| (NH4)2SO4 | Wako | 015-06737 | Ammonium sulfate precipitation |
| Ni-charged resin | Bio-Rad | 1560133 | For IMAC |
| PCR primers | Eurofins Genomics | Custom-ordered | |
| Protein standard | Bio-Rad | 161-0381 | For SDS-PAGE and western blotting |
| Solvent filtration apparatus | As One | FH-1G | |
| Spectinomycin | Wako | 195-11531 | Antibiotics; use at 100 μg/mL |
| Sterile syringe filter | Merckmillipore | SLGV004SL | 0.22 µm diameter |
| Streptococus mutans ΔgtfC | Stock strain in the lab. | gtfC replaced with spcr | |
| Streptococus mutans UA159 | Stock strain in the lab. | S. mutans ATCC 700610, Wild-type strain | |
| Sucrose | Wako | 196-00015 | For biofilm development |
| TAE (50 × ) | Nippon Gene | 313-90035 | For agarose gel electrophoresis |
| Thermal cycler | Bio-Rad | PTC-200 | |
| Tris-HCl (1 M, pH 8.0) | Wako | 314-90065 | Tris-EDTA buffer preparation |
References
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