Streptococcus mutans'larda Yüksek Moleküler Kütle Proteininin Saflaştırılması
Summary
Burada açıklanan Streptococcus mutansbir gen ürün saflaştırma için basit bir yöntemdir. Bu teknik proteinlerin saflaştırılmasında, özellikle membran proteinlerinde ve yüksek moleküler kütle proteinlerinde avantajlı olabilir ve diğer çeşitli bakteri türleri ile birlikte kullanılabilir.
Abstract
Bir genin işlevinin açıklanması genellikle ilgi geninin bozulduğunu zinde tip suşların ve suşların fenotipik özelliklerinin karşılaştırılmasını içerir. Gen bozulmasından sonra fonksiyon kaybı, bozulan genin ürününün eksojen eklenmesiyle geri kazanılır. Bu genin işlevini belirlemek için yardımcı olur. Daha önce açıklanan bir yöntem gtfC gen sekteye uğrayan Streptococcus mutans suşu oluşturmayı içerir. Burada, gtfC gen ürününü gen bozulmasından sonra yeni üretilen S. mutans suşundan arındırmak için talepedilmeyen bir yöntem tanımlanmıştır. Bu immobilize metal afinite kromatografi kullanarak gen ürün basit saflaştırma sağlayan ilgi geninin 3 ‘ sonunda bir polihistidin kodlama dizisi nin eklenmesini içerir. Bu yöntemde genetik modifikasyon için PCR dışında enzimatik reaksiyonlara gerek yoktur. Gen bozulmasından sonra gen ürününün ekolarak restorasyonu, farklı türlere de adapte edilebilen gen fonksiyonunu belirlemek için etkili bir yöntemdir.
Introduction
Bir genin işlevinin analizi genellikle ilgi geninin bozulduğunu suşlar için yabani tip suşların fenotibik özelliklerinin karşılaştırılmasını içerir. Gen bozan suşu üretildikten sonra, gen ürününün eksojen eklenmesi fonksiyonel restorasyona olanak sağlar.
Sonraki restorasyon tahlilleri için gerekli saflaştırılmış gen ürünleri elde etmek için en yaygın yöntem Escherichia coli1heterolog ifade gerçekleştirerek gereğidir. Ancak, membran proteinleri veya yüksek moleküler kütleli proteinlerin ekspresyonu genellikle bu sistemi kullanarak zordur1. Bu gibi durumlarda, hedef protein genellikle doğal olarak gen ürün kaybına yol açabilir adımlar, karmaşık bir dizi yoluyla protein sentezler hücrelerden izole edilir. Bu sorunların üstesinden gelmek için, gen bozulma yöntemi2, PCR tabanlı DNA birleştirme yöntemi3 (belirlenen iki aşamalı füzyon PCR) ve genetik için elektroporasyon aşağıdaki gen ürün arınması için basit bir prosedür geliştirilmiştir Streptococcus mutansdönüşüm . Gen ürününün C-terminusuna bir polihistidin etiketi (His-tag) eklenmesi, immobilize metal afinite kromatografisi (IMAC) ile arınmasını kolaylaştırır.
O-tag-ifade suş izole etmek için, ilgi geninin tüm genomik DNA (bu Onun etiketi ifade gen-bozulmuş suş) bir antibiyotik dirençli marker geni ile değiştirilir. His-tag-ifade gerginlik üretmek için prosedür daha önce açıklandığı gibi bir gen bozulmuş gerginlik üretmek için hemen hemen aynıdır4,5. Bu nedenle, fonksiyonel analiz için seri deney olarak gen bozulması ve gen ürün izolasyonu yöntemleri yapılmalıdır.
Bu çalışmada, bir polihistidin kodlama dizisi gtfC 3 ‘ sonuna eklenir (GenBank çekirge etiketi SMU_1005) gen, kodlama glukozyltransferase-SI (GTF-SI) S. mutans6. Daha sonra streptokok türlerinde ekspresyon çalışmaları yapıldı. E. coli ile heterolog gtfC ekspresyonuna ulaşmak, gtf-SI’nin yüksek moleküler kütlesi nedeniyle zordur. Bu tür S. mutans His-gtfC olarak adlandırılır. GtfC ve spectinomisin direnç gen kasetinin organizasyonunu gösteren şematik bir illüstrasyon (spcr) yabani tip S. mutanlarda 7 loci (S. mutans WT) ve türevleri Şekil 1. GTF-SI, karojenik dişbiyofilminingelişimine katkıda bulunan bir salgı proteinidir 6. Sakaroz varlığı altında, bir yapışık biyofilm WT S. mutans zorlanma düz bir cam yüzey üzerinde gözlenir ama S. mutans gtfC-bozulmuş suşu (S. mutans ΔgtfC)2,5 . Biyofilm oluşumu rekombinant GTF-SI ekselansları üzerine S. mutans ΔgtfC’de geri yüklenir. Suşu, S. mutans His-gtfC , daha sonra rekombinant GTF-SI üretmek içinkullanılır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Astar tasarımı protokolün en kritik adımıdır. GTFC-reverse ve spcr-forward astarlarının dizileri, gtfC’nin 3′ son bölgesi nin ve spcr’nin5′ uç bölgesinin dizilerine göre otomatik olarak belirlenmiştir. Her astar, 5’bölgelerine bir GS bağlantı layıcısını kodlayan 24 tamamlayıcı temel ve His-tag-kodlama dizisini içerir. Yukarı yayılım bölgelerinde bulunan yerel düzenleyici dizilerin bozulması, 3′ sonuna His-tag-kodlama dizilerinin eklenm…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Japonya Bilimi Destekleme Derneği (JSPS) (16K15860 ve 19K10471 ile T. M., 17K12032 to M. I., ve 18K09926 to N. H.) ve SECOM Bilim ve Teknoloji Vakfı (SECOM) (sayı hibe 2018.09.10 No. 10 10) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Agarose | Nippon Genetics | NE-AG02 | For agarose gel electrophoresis |
| Anaeropack | Mitsubishi Gas Chemical | A-03 | Anaerobic culture system |
| Anti-His-Tag monoclonal antibody | MBL | D291-7 | HRP-conjugated |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Measurement of protein concentration |
| Brain heart infusion broth | Becton, Dickinson | 237500 | Bacterial culture medium |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | For biofilm staining |
| Centrifugal ultrafiltration unit | Sartorius | VS2032 | Buffer replacement and protein concentration |
| Centrifuge | Kubota | 7780II | |
| Chromatographic column | Bio-Rad | 7321010 | For IMAC |
| Dialysis membrane clamp | Fisher brand | 21-153-100 | |
| Dialysis tubing | As One | 2-316-06 | |
| DNA polymerase | Takara | R045A | High-fidelity DNA polymerase |
| DNA sequencing | Eurofins Genomics | ||
| ECL substrate | Bio-Rad | 170-5060 | For western blotting |
| EDTA (0.5 M pH 8.0) | Wako | 311-90075 | Tris-EDTA buffer preparation |
| Electroporation cuvette | Bio-Rad | 1652086 | 0.2 cm gap |
| Electroporator | Bio-Rad | 1652100 | |
| EtBr solution | Nippon Gene | 315-90051 | For agarose gel electrophoresis |
| Gel band cutter | Nippon Genetics | FG-830 | |
| Gel extraction kit | Nippon Genetics | FG-91202 | DNA extraction from agarose gel |
| Imager | GE Healthcare | 29083461 | For SDS-PAGE and western blotting |
| Imidazole | Wako | 095-00015 | Binding buffer and elution buffer preparation |
| Incubator | Nippon Medical & Chemical Instruments | EZ-022 | Temperature setting: 4 °C |
| Incubator | Nippon Medical & Chemical Instruments | LH-100-RDS | Temperature setting: 37 °C |
| Membrane filter | Merck Millipore | JGWP04700 | 0.2 µm diameter |
| Microcentrifuge | Kubota | 3740 | |
| NaCl | Wako | 191-01665 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| NaH2PO4·2H2O | Wako | 192-02815 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| NaOH | Wako | 198-13765 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| (NH4)2SO4 | Wako | 015-06737 | Ammonium sulfate precipitation |
| Ni-charged resin | Bio-Rad | 1560133 | For IMAC |
| PCR primers | Eurofins Genomics | Custom-ordered | |
| Protein standard | Bio-Rad | 161-0381 | For SDS-PAGE and western blotting |
| Solvent filtration apparatus | As One | FH-1G | |
| Spectinomycin | Wako | 195-11531 | Antibiotics; use at 100 μg/mL |
| Sterile syringe filter | Merckmillipore | SLGV004SL | 0.22 µm diameter |
| Streptococus mutans ΔgtfC | Stock strain in the lab. | gtfC replaced with spcr | |
| Streptococus mutans UA159 | Stock strain in the lab. | S. mutans ATCC 700610, Wild-type strain | |
| Sucrose | Wako | 196-00015 | For biofilm development |
| TAE (50 × ) | Nippon Gene | 313-90035 | For agarose gel electrophoresis |
| Thermal cycler | Bio-Rad | PTC-200 | |
| Tris-HCl (1 M, pH 8.0) | Wako | 314-90065 | Tris-EDTA buffer preparation |
References
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition. , (2001).
- Murata, T., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. Method for functional analysis of a gene of interest in Streptococcus mutans: gene disruption followed by purification of a polyhistidine-tagged gene product. Journal of Microbiological Methods. 155, 49-54 (2018).
- Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).
- Murata, T., Hanada, N. Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans. FEMS Microbiology Letters. 363 (11), 101 (2016).
- Murata, T., Okada, A., Matin, K., Hanada, N. Generation of a gene-disrupted Streptococcus mutans strain without gene cloning. Journal of Visualized Experiments. (128), (2017).
- Hanada, N., Kuramitsu, H. K. Isolation and characterization of the Streptococcus mutansgtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans. Infection and Immunity. 56 (8), 1999-2005 (1988).
- LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 35 (9), 1804-1810 (1991).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Database, J. S. E. PCR: The Polymerase Chain Reaction. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Database, J. S. E. DNA Gel Electrophoresis. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Database, J. S. E. Gel Purification. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Wingfield, P. T. Protein precipitation using ammonium sulfate. Current Protocols in Protein Science. 84 (1), (2016).
- Database, J. S. E. Separating Protein with SDS-PAGE. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Database, J. S. E. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
- Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans. Infection and Immunology. 41 (2), 722-727 (1983).
- Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency. Journal of Microbiological Methods. 49 (2), 193-205 (2002).
- Ge, X., Xu, P. Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
