Två-foton kalcium Imaging i nervcellernas dendriter i hjärnan skivor

Bidraget av en neuron till nätverksaktivitet bestäms till stor del av den dynamiska karaktären av de synaptic ingångarna som det mottar. Traditionellt, åberopade den dominerande metoden för att karaktärisera synaptisk aktivitet i nervceller somatiska hela-cell patch-clamp inspelningar av postsynaptiska strömmar frammanade genom elektrisk stimulering av axoner av passagen. Enda verksamhet som proximalt belägna synapserna rapporteras dock sanningsenligt i detta fall¹. Dessutom, för att bedöma de synaps-specifika mekanismerna, har inspelningar från par av nervceller och dendriter på en viss plats använts att rikta synapserna sevärdheter och mekanismerna för dendritiska integration, respektive. Ett stort genombrott i fältet i synaptic fysiologi uppnåddes genom ett äktenskap mellan optisk och elektrofysiologiska tekniker. Två-foton excitation laserscanning mikroskopi (2PLSM) i kombination med Ca^{2 +} imaging och optogenetic verktyg kan avslöja enorma Detaljer för den dynamiska organisationen av synaptisk aktivitet på specifika neuronala anslutningar i hjärnan skivor i vitro och in-vivo.

Flera viktiga fördelar gjorde 2PLSM sticker ut från den konventionella, one-photon excitation mikroskopi²: (1) på grund av en ickelinjär natur av två-photon excitation, fluorescensen skapas endast i focal volymen och alla avgivna fotonerna representerar användbara signaler (inget behov för pinhole); (2) längre våglängder, används i 2PLSM, penetrera scattering vävnaden mer effektivt; spridda fotoner är dessutom alltför utspädd att producera två-photon excitation och bakgrunden fluorescens; (3) photodamage och fototoxicitet är också begränsad till fokalplanet. Trots den höga kostnaden av 2-foton system jämfört med konventionella confocal Mikroskop förblir 2PLSM därför en metod för val av högupplösta utredning av neuronala struktur och funktion i tjock levande vävnad.

Den första tillämpningen av 2PLSM i scattering vävnad var att bild struktur och funktion av Dendritutskotten³. 2PLSM i kombination med Ca^{2 +} imaging har avslöjat att spines funktion som isolerade biokemiska fack. Sedan i många neuronala typer finns det en one-to-one överensstämmelse mellan ryggar och enskilda synapserna⁴, blev två-photon Ca^{2 +} imaging snart ett användbart verktyg för rapportering av enskilda synapserna i intakt vävnad^{5, 6,7,8}. 2PLSM-baserade Ca^{2 +} imaging har dessutom framgångsrikt använts för att övervaka aktiviteten hos enda kalciumkanaler och ickelinjära samspelet mellan de inneboende och synaptic conductances, samt att bedöma den statliga – och aktivitet-beroende reglering av Ca^{2 +} signalering i nervcellernas dendriter^{5,6,7,8,9,10,11}.

Kalcium är en allestädes närvarande intracellulära andra budbärare, och dess subcellulär spatiotemporal organisation bestämmer riktningen av fysiologiska reaktioner, från förändringar i synaptisk styrka till regleringen av ion kanaler, dendrite och ryggraden tillväxt, som samt celldöd och överlevnad. Dendritiska Ca^{2 +} höjder uppstå via aktivering av flera vägar. Handlingspänningar (APs), backpropagating till dendriter, öppnar spänningskänsliga kalcium kanaler¹² och producera relativt globala Ca^{2 +} transienter (katter) i dendriter och ryggar¹³. Synaptisk transmission är associerad med aktivering av postsynaptiska Ca^{2 +}-permeable receptorer (NMDA, Ca^{2 +}-genomsläpplig AMPA och kainate), utlöser synaptic katter^6,14,15. Slutligen kan supralinear Ca^{2 +} händelser genereras i dendriter enligt vissa villkor^11,12,13,16.

Två-foton Ca^{2 +} imaging i kombination med patch-clamp elektrofysiologiska inspelningar sysselsätter syntetiska Ca^{2 +}-känsliga fluorescerande indikatorer som levereras vanligtvis via lapp elektroden under hela-cell recordings . En schablonmässig metod för kvantifiering av Ca^{2 +} dynamics är baserad på den dubbla indikator metod^17,18. Den använder två fluorophores med väl separerade utsläpp spectra (t.ex., en kombination av en röd Ca^{2 +}-okänsliga färgämne med grön Ca^{2 +} indikatorer, såsom Oregon grön BAPTA-1 eller Fluo-4) och har flera fördelar jämfört med den enskild indikator metod. Första, en Ca^{2 +}-okänsliga dye används för att leta upp små strukturer av intresse (dendritiska grenar och taggar) där Ca^{2 +} avbildning kommer att utföras. Det andra beräknas förhållandet mellan förändringen i grön och röd fluorescens (ΔG/R) som ett mått på [Ca^{2 +}], vilket är i stort sett okänsliga för förändringar i baslinjen fluorescens på grund av fluktuationer i [Ca^{2 +}]₀^{17 , 18}. Dessutom fluorescens förändringar kan kalibreras när det gäller absoluta Ca^{2 +} koncentrationer¹⁹.

En allmän oro när kör två-photon Ca^{2 +} imaging experiment i akut skivor är cell hälsa och stabilitet av förvärvet bild på grund av den höga lasereffekt som vanligtvis används. Dessutom finns Ca^{2 +} imaging experiment, oro om störning och betydande överskattning av subcellulär Ca^{2 +} dynamics på grund av att Ca^{2 +} indikatorer fungera som lättrörliga exogena Ca^{2 +} buffertar. Alltså, valet av Ca^{2 +} indikatorn och dess koncentration beror på typ av neuronala, förväntade amplituden av katter och på experimentell frågan.

Vi anpassat metoden för två-photon Ca^{2 +} imaging för utredning av Ca^{2 +} fluktuationer i dendriter GABAergic interneuroner^{9,10,11,20,21 , 22}. medan huvuddelen av tidig Ca^{2 +} imaging studier var gjort i huvudsakliga nervceller, hämmande interneuroner Visa upp en stor mängd funktionella Ca^{2 +} mekanismer som skiljer sig från dem i pyramidala celler^{20 , 23 , 24}. dessa interneuron-specifika mekanismer (t.ex., Ca^{2 +} genomsläpplig AMPA-receptorer) kan spela specifika roller i reglera cellernas aktivitet. Dendritiska Ca^{2 +} signalering i interneuronen är ett lockande mål för vidare utredning, presenterar två-photon Ca^{2 +} imaging i dendriter av dessa celler ytterligare utmaningar, från en tunnare diameter av dendriter och avsaknaden av taggar till en särskilt hög endogen Ca^{2 +} bindande kapacitet. Som vårt forskningsintresse fokuserar på studier av hippocampus interneuroner, anpassades följande protokoll, medan gäller för olika neuronala populationer, till ta itu med dessa utmaningar.

Detta protokoll avrättades med en kommersiell confocal två-foton Mikroskop, som var utrustad med två externa, icke-descanned detektorer (NPF), Elektro-optiska modulator (EOM) och en Dodt skanning gradient kontrast (SGC), och installeras på en optisk tabell. Mikroskopet var förenat med en multiphoton TI: safirlaser läge-låst vid 800 nm (> 3 W, 140 fs pulser, 80 Hz repetition rate). Bildsystem var utrustad med en standard elektrofysiologi rigg, inklusive en perfusion kammare med en översättning plattform med två micromanipulators, en digitizer, en datorstyrd mikroelektrod förstärkare, temperaturkontroll, en stimulering enheten, och data förvärv programvara.