Proyección de imagen de calcio de dos fotones en las dendritas neuronales en rebanadas de cerebro

La contribución de una neurona a la actividad de la red está determinada por la naturaleza dinámica de las entradas sinápticas que recibe. Tradicionalmente, el método predominante de caracterizar la actividad sináptica en las neuronas dependía de grabaciones somáticas celulares-abrazadera del remiendo de corrientes postsynaptic evocadas por la estimulación eléctrica de los axones de paso. Sin embargo, única actividad de la sinapsis situada proximally se divulga con la verdad en este caso¹. Además, para evaluar los mecanismos específicos de la sinapsis, se han utilizado grabaciones de pares de neuronas y dendritas en un lugar específico a las sinapsis de interés y los mecanismos de integración dendrítica, respectivamente. Se logró un gran avance en el campo de la Fisiología sináptica a través de una combinación de técnicas ópticas y electrofisiológicas. Láser de excitación de dos fotones microscopía (2PLSM) en combinación con herramientas de optogenetic y Ca^{2 +} la proyección de imagen puede revelar grandes detalles de la organización dinámica de la actividad sináptica en las conexiones neuronales específicas en rebanadas de cerebro en Vitro e in vivo.

Varias ventajas claves hecho 2PLSM sobresalen la excitación convencional, un fotón microscopia²: (1) debido al carácter no lineal de excitación de dos fotones, la fluorescencia se genera solamente en el volumen focal, y representan todos los fotones emitidos señales útiles (sin necesidad de agujero de alfiler); (2) más de largo longitudes de onda, utilizados en 2PLSM, penetran en el tejido de dispersión más eficiente; Además, los fotones dispersos son demasiado diluidos para producir la excitación de dos fotones y la fluorescencia del fondo; (3) fotoenvejecimiento y fototoxicidad también se limitan al plano focal. Por lo tanto, a pesar del alto costo de los sistemas 2-fotón en comparación con los microscopios confocales convencionales, la 2PLSM sigue siendo un método de elección para la investigación de alta resolución de la estructura neuronal y función en tejido grueso vivo.

El primer uso de 2PLSM en el tejido de dispersión fue la imagen de la estructura y función de espinas dendríticas³. 2PLSM en combinación con Ca^{2 +} la proyección de imagen ha revelado esa función de espinas como compartimientos bioquímicos aislados. Ya que en muchos tipos neuronales existe una correspondencia biunívoca entre espinas y las sinapsis individuales⁴, dos fotones Ca^{2 +} imagen pronto se convirtió en una útil herramienta de reporting de la actividad de las sinapsis individuales en el tejido intacto^{5, 6,7,8}. Además, basado en la 2PLSM Ca^{2 +} proyección de imagen fue utilizado con éxito para supervisar la actividad de los canales de calcio solo y las interacciones no lineales entre las conductancias intrínsecas y sinápticas, así como para evaluar el estado y actividad dependiente regulación de Ca^{2 +} en las dendritas neuronales^{5,6,7,8,9,10,11}.

El calcio es un segundo mensajero intracelular ubicuo y su organización espacio-temporal subcelular determina la dirección de las reacciones fisiológicas, de los cambios en fuerza sináptica a la regulación de iones canales, crecimiento de la dendrita y la columna vertebral, como así como la muerte celular y la supervivencia. Dendríticas Ca^{2 +} elevaciones se producen mediante la activación de múltiples vías. Potenciales de acción (APs), backpropagating a las dendritas, abre voltaje-bloqueado calcio canales¹² y producir a relativamente global Ca^{2 +} transitorios (gatos) en las dendritas y espinas¹³. Transmisión sináptica se asocia con la activación de postsynaptic Ca^{2 +}-permeables receptores (NMDA, Ca^{2 +}-permeable al AMPA y kainato), activación sináptica gatos de^14,6,15. Por último, pueden generarse supralinear Ca^{2 +} eventos en dendritas bajo ciertas condiciones^11,12,13,16.

Emplea dos fotones Ca^{2 +} proyección de imagen en combinación con las grabaciones electrofisiológicas abrazadera del remiendo sintético Ca^{2 +}-indicadores fluorescentes sensibles, que por lo general se entregan a través de los electrodos de parche durante grabaciones de celulares . Un método estándar para la cuantificación de la dinámica de Ca^{2 +} se basa en el método de doble indicador^17,18. Utiliza dos fluoróforos con espectros de emisión bien separados (p. ej., una combinación de un rojo Ca^{2 +}-insensible tinta verde Ca^{2 +} indicadores, tales como verde de Oregon BAPTA-1 o Fluo-4) y tiene varias ventajas en comparación con el método de indicador único. Primero, una Ca^{2 +}-insensible tinte se utiliza para localizar pequeñas estructuras de interés (ramas dendríticos y espinas) donde se realizará la proyección de imagen de Ca^{2 +} . En segundo lugar, la relación entre el cambio en la fluorescencia verde y rojo (ΔG/R) se calcula como una medida de la [Ca^{2 +}], que es en gran parte insensible a los cambios en la fluorescencia basal debido a fluctuaciones en la [Ca^{2 +}]₀^{17 , 18}. por otra parte, cambios de fluorescencia pueden ser calibradas en términos de absoluta Ca^{2 +} concentraciones¹⁹.

Una preocupación general cuando dos fotones Ca^{2 +} de los experimentos en rebanadas agudos es celular salud y estabilidad de la adquisición de la imagen debido a la potencia del láser alta que normalmente se utiliza. Además, en experimentos de Ca^{2 +} proyección de imagen, hay preocupación por la perturbación y considerable sobreestimación de subcelular Ca^{2 +} dinámica debido a que los indicadores de Ca^{2 +} actúan como móvil altamente exógeno Ca^{2 +} almacenadores intermediarios. Por lo tanto, la elección del indicador de Ca^{2 +} y su concentración depende del tipo neuronal, la amplitud esperada de gatos y de la pregunta experimental.

Adaptamos el método de dos fotones Ca^{2 +} proyección de imagen para investigación de Ca^{2 +} las fluctuaciones en las dendritas de GABAérgico interneuronas^{9,10,11,20,21 , 22}. mientras que la mayor parte de los primeros Ca^{2 +} imagen estudios se realizaron en las principales neuronas, inhibitorios interneurons mostrar una gran variedad de funciones Ca^{2 +} mecanismos que son distintas a las de las células piramidales^{20 , 23 , 24}. estos mecanismos específicos de interneurona (p. ej., Ca^{2 +} permeable AMPA receptores) pueden desempeñar papeles específicos en la regulación de la actividad de la célula. Dendríticas Ca^{2 +} en interneuronas es un objetivo tentador para la posterior investigación, dos fotones Ca^{2 +} en las dendritas de estas células presenta desafíos adicionales, de un diámetro más fino de las dendritas y la falta de espinas para una particularmente alta Ca^{2 +} vinculante capacidad endógena. Como nuestra investigación intereses se centran en el estudio de interneurons hippocampal, el siguiente protocolo, si bien aplicable a distintas poblaciones neuronales, fue adaptado para hacer frente a esos desafíos.

Este protocolo fue ejecutado con un microscopio confocal comercial de dos fotones, que fue equipado con dos detectores externos, no descanned (NDDs), modulador electro-óptico (MOE) y un Dodt exploración contraste degradado (SGC) e instalado sobre una mesa óptica. El microscopio fue juntado con un láser de TI: zafiro multifotón modo-bloqueado a 800 nm (> 3 W 140 pulsos de fs, tasa de repetición de 80 Hz). El sistema de proyección de imagen fue equipado con una plataforma de electrofisiología estándar, incluyendo una cámara de perfusión con control de temperatura, una plataforma de traducción con dos micromanipuladores, un amplificador controlado por ordenador del microelectrodo, un digitalizador, un estímulo unidad y software de adquisición de datos.