Двух Фотон кальция изображений в нейрональных дендритов в срезах головного мозга

Вклад нейрона для сетевой активности во многом определяется динамичный характер синаптических входов, которые он получает. Традиционно преобладает метод характеризации синаптической активности нейронов полагались на записи соматических поклеточного патч зажим постсинаптических токов, вызываемые электрической стимуляции аксонов прохода. Однако только активность проксимально расположен синапсы правдиво сообщили в этом случае¹. Кроме того для оценки СИНАПС конкретные механизмы, записи из пар нейронов и дендритов в определенном месте использовались для целевой синапсы интерес и механизмы дендритных интеграции, соответственно. Крупным прорывом в области физиологии синаптических была достигнута через брак оптических и электрофизиологических методов. Двух Фотон возбуждения лазерной сканирующей микроскопии (2PLSM) в сочетании с Ca^{2 +} изображений и optogenetic инструменты можно выявить огромный детали динамической организации синаптической активности на конкретных нейрональных связей в ломтики мозга в in vitro и в естественных условиях.

Несколько ключевых преимуществ сделал 2PLSM выделяется из обычных, один фотон возбуждения микроскопии²: (1) вследствие нелинейного характера возбуждения двух фотонов, флюоресценция генерируется только в том фокуса, а представляют всех излучаемых фотонов полезных сигналов (нет необходимости для обскуры); (2) больше волн, используемых в 2PLSM, проникать в ткани рассеяния более эффективно; Кроме того рассеянных фотонов слишком разреженных производить два Фотон возбуждения и фон флуоресценции; (3) фотоповреждения и Фототоксичность также ограничены в фокальной плоскости. Таким образом несмотря на высокую стоимость 2-фотонных систем по сравнению с обычными конфокальные микроскопы, 2PLSM по-прежнему является методом выбора для высокого разрешения исследования нейронов структуры и функции в густой живой ткани.

Первое применение 2PLSM в тканях рассеяния было изображение структуры и функции дендритных шипиков³. 2PLSM в сочетании с Ca^{2 +} изображений показал что колючки функции как биохимические изолированных отсеков. Поскольку во многих типов нейронов существует однозначное соответствие между шипами и отдельных синапсы⁴, два Фотон Ca^{2 +} изображений вскоре стал полезным инструментом отчетности деятельности отдельных синапсов в неповрежденной ткани^{5, 6,,78}. Кроме того на основе 2PLSM Ca^{2 +} изображений был успешно используется для мониторинга активности одного кальциевых каналов и нелинейных взаимодействий между внутренней и синаптическую проводимости, а также для оценки состояния и активности зависит от регулирование Ca^{2 +} сигнализации в нейрональных дендритов^{5,6,,78,9,10,11}.

Кальций является вездесущий внутриклеточных второй messenger, и его субцеллюлярные пространственно-временных организация определяет направление физиологических реакций, от изменений в синаптической силы к регулированию Ион каналы, роста дендритов и позвоночника, как а также гибель клеток и выживания. Дендритных Ca^{2 +} фасады происходят через активацию нескольких путей. Потенциалы действия (APs), backpropagating к дендритов, открыть напряжения закрытый кальций каналы¹² и производят относительно глобальной Ca^{2 +} транзиентов (кошки) в дендритов и колючки¹³. Синаптической передачи связан с активацией постсинаптических Ca^{2 +}-проницаемой рецепторов (NMDA, Ca^{2 +}-проницаемой АМПА и kainate), вызывает синаптических кошки^6,14,15. Наконец supralinear Ca^{2 +} события могут быть созданы в дендриты при определенных условиях^11,12,13,16.

Двух Фотон Ca^{2 +} изображений в сочетании с патч зажим электрофизиологических записей использует синтетический Ca^{2 +}-чувствительных люминесцентные Индикаторы, которые доставляются через электрод патч во время записи поклеточного . Стандартный метод для количественной оценки Ca^{2 +} динамики на основе двойной индикатор метод^17,18. Он использует два флуорофоров с хорошо разделенных спектры выбросов (например, сочетание красного Ca^{2 +}-нечувствительным краска с зеленым Ca^{2 +} индикаторы, такие как Орегон Грин BAPTA-1 или Fluo-4) и имеет ряд преимуществ по сравнению с единый индикатор метод. Во-первых, Ca^{2 +}-нечувствительным краска используется для обнаружения небольших структур интерес (дендритных филиалов и колючки) где будет выполняться Ca^{2 +} изображений. Во-вторых отношение между изменением в зеленой и красной флуоресценцией (ΔG/R) вычисляется как мера [Ca^{2 +}], который является в значительной степени нечувствительны к изменения в базовых флуоресценции колебаниями в [Ca^{2 +}]₀^{17 , 18}. Кроме того, изменения флюоресценции может быть откалиброван с точки зрения абсолютной Ca^{2 +} концентрации¹⁹.

Общая озабоченность при выполнении двух Фотон Ca^{2 +} изображений эксперименты в острых фрагментов является здоровье клеток и стабильность захвата изображений из-за высокой лазерной энергии обычно используется. Кроме того в Ca^{2 +} изображений экспериментов, существует озабоченность по поводу возмущений и существенной переоценки субцеллюлярные Ca^{2 +} динамики, с тем, что Ca^{2 +} индикаторы действовать как Высокомобильные внешних Ca^{2 +} буферы. Таким образом выбор Ca^{2 +} индикатор и его концентрация зависит от нейронов типа, ожидаемого амплитуда кошек и экспериментальной вопрос.

Мы адаптировали метод двух Фотон Ca^{2 +} изображений для расследования Ca^{2 +} колебаний в дендриты ГАМК интернейронов^{9,10,11,20,21 , 22}. в то время как основная часть ранних Ca^{2 +} тепловизионные исследования были сделаны в главных нейронов, тормозящий интернейронов продемонстрировать большое разнообразие функциональных Ca^{2 +} механизмов, которые отличаются от тех, кто в пирамидальных клеток^{20 , 23 , 24}. Эти межнейронного конкретные механизмы (например, Ca^{2 +} проницаемых АМПА рецепторов) могут играть конкретную роль в регулировании клеточной активности. Хотя дендритных Ca^{2 +} сигнализации в интернейронов заманчиво мишенью для дальнейшего расследования, два Фотон Ca^{2 +} изображений в дендриты этих клеток представляет дополнительные проблемы, от тонкого диаметра дендритов и отсутствием шипов для особенно высокой эндогенного Ca^{2 +} связывающая способность. Как наши исследовательские интересы сосредоточиться на изучении гиппокампа интернейронов, следующий протокол, в то время, как это применимо к различных нейрональных популяций, была адаптирована для решения этих проблем.

Этот протокол был казнен с коммерческой Конфокальный микроскоп двух фотонов, который был оборудован двумя внешними, не descanned детекторы (NDDs), электро оптический модулятор (МНВ) и Dodt, сканирование градиент контрастности (SGC) и установлен на таблицы оптики. Микроскоп был увязан с титан-сапфировый лазер multiphoton locked режиме на 800 Нм (> 3 Вт, 140 fs импульсов, частота следования импульсов 80 Гц). Система электронного фотографирования была оснащена стандартным электрофизиологии Рог, включая камеру перфузии с контроля температуры, перевод платформы с двумя микроманипуляторы, управляемая компьютером микроэлектродные усилитель, дигитайзера, стимуляции подразделение и программное обеспечение для сбора данных.