Zwei-Photonen-Kalzium Imaging in neuronalen Dendriten in Hirnschnitten

Der Beitrag eines Neurons, Netzwerk-Aktivität richtet sich weitgehend nach der dynamischen Natur der synaptischen Eingänge, die er empfängt. Traditionell, stützte sich die vorherrschende Methode der Charakterisierung synaptische Aktivität in Nervenzellen auf somatische ganze Zelle Patch-Clamp-Aufnahmen von postsynaptischen Ströme, hervorgerufen durch elektrische Stimulation von Axonen der Passage. Einzige Aktivität der proximal befindet sich Synapsen wird jedoch in diesem Fall¹wahrheitsgemäß gemeldet. Darüber hinaus wurden um die Synapse-spezifische Mechanismen zu beurteilen, Aufnahmen von Paaren von Neuronen und von Dendriten an einem bestimmten Ort zur Synapsen von Interesse und die Mechanismen der dendritischen Integration bzw. Ziel. Ein wichtiger Durchbruch auf dem Gebiet der synaptischen Physiologie wurde durch eine Heirat von optischen und elektrophysiologische Techniken erreicht. Zwei-Photon Erregung Laser-scanning-Mikroskopie (2PLSM) in Kombination mit Ca^{2 +} Bildgebung und optogenetische Tools kann enorme Details der dynamischen Organisation der synaptischen Aktivität an bestimmten neuronalen Verbindungen im Gehirnscheiben in offenbaren. Vitro und in Vivo.

Einige wesentliche Vorteile hat 2PLSM von den herkömmlichen, ein Photon Erregung Mikroskopie²abheben: (1) aufgrund einer nichtlinearen Natur der zwei-Photonen-Anregung die Fluoreszenz nur im fokalen Volumen erzeugt, und vertreten alle emittierte Photonen nützliche Signale (keine Notwendigkeit für Lochkamera); (2) längere Wellenlängen, in 2PLSM, durchdringen das Gewebe Streuung effizienter; Darüber hinaus sind die gestreute Photonen zu verdünnen, Hintergrundfluoreszenz und zwei-Photon Erregung zu produzieren; (3) lichtbedingten und Phototoxizität sind auch auf der Brennebene beschränkt. Die 2PLSM bleibt daher trotz der hohen Kosten der 2-Photonen-Systeme im Vergleich zu herkömmlichen konfokale Mikroskope, eine Methode der Wahl für hochauflösende Untersuchung der neuronalen Struktur und Funktion in dicken lebendes Gewebe.

Die erste Anwendung des 2PLSM im Streuung Gewebe war es, die Struktur und Funktion der dendritischen Dornen³Bild. 2PLSM in Kombination mit Ca^{2 +} Bildgebung ergab, dass Wirbelsäulen-Funktion als isolierten biochemischen Fächer. Da in vielen neuronalen Arten gibt es eine 1: 1-Entsprechung zwischen Dornen und einzelne Synapsen⁴, wurde zwei-Photon Ca^{2 +} imaging bald ein nützliches Werkzeug, das die Aktivität der einzelnen Synapsen bei intaktem Gewebe^{5Berichterstattung, 6,7,8}. Darüber hinaus wurde 2PLSM-basierte Ca^{2 +} Bildgebung erfolgreich um die Aktivität der einzelnen Calciumkanäle und die nichtlinearen Wechselwirkungen zwischen der inneren und synaptischen maßgearbeitet überwachen sowie Zustand und aktivitätsabhängige bewerten eingesetzt Regulierung von Ca^{2 +} Signalisierung in neuronalen Dendriten^{5,6,7,8,9,10,11}.

Calcium ist ein allgegenwärtiges intrazellulären zweite Bote, und seine subzelluläre räumlich-zeitliche Organisation bestimmt die Richtung des physiologischen Reaktionen von Änderungen in der synaptischen Stärke bei der Regulierung von Ionen-Kanäle, Dendriten und Wirbelsäule Wachstum als Zelle Tod und überleben. Dendritische Ca^{2 +} Erhebungen erfolgen über Aktivierung des mehrere Wege. Aktionspotentiale (APs), Backpropagating, die Dendriten öffnen Voltage-gated Kalzium-Kanäle¹² und produzieren relativ globale Ca^{2 +} Transienten (Katzen) in Dendriten und Stacheln¹³. Synaptische Übertragung ist verbunden mit der Aktivierung der postsynaptischen Ca^{2 +}-durchlässigen Rezeptoren (NMDA, Ca^{2 +}-durchlässigen AMPA und Kainate),^6,14,15Katzen auslösen synaptische. Schließlich werden in Dendriten unter bestimmten Bedingungen^11,12,13,16Supralinear Ca^{2 +} Ereignisse generiert.

Zwei-Photonen-Ca^{2 +} Bildgebung in Kombination mit Patch-Clamp elektrophysiologische Aufnahmen beschäftigt synthetische Ca^{2 +}-empfindliche fluoreszierenden Indikatoren, die in der Regel durch die Patch-Elektrode während der gesamten Zelle Aufnahmen geliefert werden . Eine Standardmethode zur Quantifizierung von Ca^{2 +} Dynamik basiert auf der dual-Anzeige Methode^17,18. Er verwendet zwei Fluorophore mit gut getrennten Emissionsspektren (z.B., eine Kombination aus einem roten Ca^{2 +}-unempfindliche Farbe mit grünen Ca^{2 +} Indikatoren, wie Oregon Green BAPTA-1 oder Fluo-4) und hat mehrere Vorteile gegenüber der einzigen Indikator Methode. Erstens, eine Ca^{2 +}-unempfindlich Farbstoff wird verwendet, um suchen kleine Strukturen von Interesse (dendritische Verzweigungen und Stacheln) wo Ca^{2 +} Bildgebung erfolgen. Zweitens wird das Verhältnis zwischen den grünen und roten Fluoreszenz (ΔG/R) als Maß für die [Ca^{2 +}], berechnet, ist weitgehend unempfindlich gegen Veränderungen der Grundlinie Fluoreszenz aufgrund der schwankenden [Ca^{2 +}]₀^{17 , 18}. Darüber hinaus können Fluoreszenz Änderungen in Bezug auf absolute Ca^{2 +} -Konzentrationen¹⁹kalibriert werden.

Eine allgemeine Beschwerde beim laufen zwei-Photon Ca^{2 +} bildgebender Experimenten in akuten Scheiben ist Zelle Gesundheit und Stabilität der Bildaufnahme durch die hohe Laserleistung, die in der Regel verwendet. Zusätzlich in Ca^{2 +} bildgebenden Experimenten gibt es Besorgnis über die Störung und erheblichen Überschätzung der subzellulären Ca^{2 +} Dynamik da Ca^{2 +} Indikatoren als hochmobile exogene Ca^{2 +} handeln Puffer. Somit hängt die Wahl der Ca^{2 +} Kennzeichen und seine Konzentration auf die neuronalen Art, die erwartete Amplitude der Katzen und der experimentellen Frage.

Wir die Methode der zwei-Photonen-Ca^{2 +} Bildgebung für die Untersuchung von Ca^{2 +} Schwankungen in Dendriten der GABAergen Interneuronen^{9,10,11,20,21} angepasst ^{, 22}. während der Großteil der frühen Ca^{2 +} bildgebenden Studien erfolgten in den wichtigsten Neuronen, hemmende Interneurone präsentieren eine Vielzahl von funktionalen Ca^{2 +} Mechanismen unterscheiden sich von denen in Pyramidenzellen^{20 , 23 , 24}. diese Interneuron-spezifische Mechanismen (z.B. Ca^{2 +} durchlässig AMPA-Rezeptoren) können bestimmte Rollen bei der Regulierung der Aktivität der Zellen spielen. Während dendritischen Ca^{2 +} signalisieren in den Interneuronen ein verlockendes Ziel für weitere Untersuchungen ist, präsentiert zwei-Photon Ca^{2 +} Bildgebung in Dendriten dieser Zellen zusätzliche Herausforderungen, aus einem dünneren Durchmesser von Dendriten und Mangel an Stacheln eine besonders hohe endogene Ca^{2 +} -Bindungskapazität. Wie unsere Fokus auf die Untersuchung der hippocampalen Interneuronen Forschungsinteressen, wurde das folgende Protokoll, während auf verschiedenen neuronalen Populationen anwendbar zur Bewältigung dieser Herausforderungen angepasst.

Dieses Protokoll wurde mit einem kommerziellen konfokale zwei-Photonen-Mikroskop ausgeführt mit zwei externen, nicht descanned Detektoren (NDDs), Elektro-optischer Modulator (EOM) und ein Dodt Scannen gradient Kontrast (SGC) ausgestattet, und auf einer optischen Tisch installiert. Das Mikroskop wurde gepaart mit einem Exklusivrepräsentation multiphoton Laser modengekoppelten bei 800 nm (> 3 W, 140 fs Impulsen, 80 Hz Wiederholrate). Die imaging-System wurde mit einem standard Elektrophysiologie-Rig, einschließlich einer Perfusion Kammer mit einer Übersetzung Plattform mit zwei Mikromanipulatoren, eine computergesteuerte Mikroelektrode Verstärker, ein Digitizer, Temperaturregelung, eine Stimulation ausgestattet. Einheit und Datenerfassungs-Software.