Imagerie biphotonique Calcium en Dendrites neuronales dans des tranches de cerveau

La contribution d’un neurone à l’activité du réseau est en grande partie déterminée par la nature dynamique des entrées synaptiques qu’il reçoit. Traditionnellement, la principale méthode de caractérisation de l’activité synaptique dans les neurones s’est fondé sur les enregistrements de patch-clamp de la cellule entière somatique des courants postsynaptiques évoqués par stimulation électrique des axones de passage. Toutefois, la seule activité des synapses situées dans la partie proximale est véridiquement signalée dans ce cas¹. En outre, afin d’évaluer les mécanismes spécifiques à synapse, enregistrements de paires de neurones et de dendrites à un endroit précis ont été utilisés pour cibler les synapses d’intérêt et les mécanismes d’intégration dendritique, respectivement. Une percée majeure dans le domaine de la physiologie synaptique a été atteint par un mariage des techniques optiques et électrophysiologiques. Excitation biphotonique microscopie à balayage laser (2PLSM) en combinaison avec les outils d’optogenetic et de Ca^{2 +} imagerie peut révéler des détails extraordinaires de l’organisation dynamique de l’activité synaptique à connexions neuronales spécifiques dans des tranches de cerveau dans vitro et in vivo.

Plusieurs avantages principaux faits 2PLSM se démarquer de l’excitation classiques, un photon microscopy²: (1) en raison de la nature non linéaire d’excitation à deux photons, la fluorescence est générée uniquement dans le volume focal, et représentent tous les photons émis signaux utiles (pas besoin de trou d’épingle) ; (2) longueurs d’onde, utilisés en 2PLSM, pénètrent dans les tissus de diffusion plus efficacement ; en outre, les photons dispersés sont trop diluées pour produire l’excitation biphotonique et fluorescence de fond ; (3) le photovieillissement et phototoxicité sont également limités à plan focal. Par conséquent, malgré le coût élevé des systèmes 2 photons par rapport aux microscopes confocaux classiques, la 2PLSM reste une méthode de choix pour enquête à haute résolution de structure neuronale et la fonction dans les tissus vivants épais.

La première application de 2PLSM dans les tissus de diffusion a été à l’image de la structure et la fonction des épines dendritiques³. 2PLSM en combinaison avec Ca^{2 +} imagerie a révélé cette fonction d’épines comme des compartiments isolés biochimiques. Puisque de nombreux types de neurones, il y a une correspondance biunivoque entre les épines et les synapses individuels⁴, deux photons Ca^{2 +} imagerie bientôt est devenu un outil de reporting de l’activité des synapses individuelles en tissu intact^{5, 6,7,8}. En outre, 2PLSM Ca^{2 +} imagerie a été utilisée avec succès pour surveiller l’activité des canaux calciques unique et les interactions non linéaires entre les conductivités intrinsèques et synaptiques, ainsi que d’évaluer l’État et l’activité dépendante- régulation du Ca^{2 +} signalisation neuronale dendrites^{5,6,7,8,9,10,11}.

Le calcium est un omniprésent second messager intracellulaire, et son organisation spatio-temporelle subcellulaire détermine la direction de réactions physiologiques, de modifications de la force synaptique à la régulation des ions canaux, croissance dendritique et la colonne vertébrale, comme Bien que la mort cellulaire et la survie. Dendritiques Ca^{2 +} élévations se produisent via l’activation de multiples voies. Potentiels d’action (PA), backpropagating pour les dendrites, ouvrir de canaux voltage-dépendants de calcium¹² et produire des transitoires relativement globales Ca^{2 +} (chats) dans les dendrites et les épines¹³. La transmission synaptique est associée à l’activation de postsynaptique Ca^{2 +}-récepteurs perméables (NMDA, Ca^{2 +}-perméable AMPA et kaïnate), déclenchement synaptique chats^6,14,15. Enfin, SUPRALINÉAIRE Ca^{2 +} événements peuvent être générés en dendrites sous certaines conditions^11,12,13,16.

Deux photons Ca^{2 +} imagerie en combinaison avec les enregistrements électrophysiologiques de patch clamp emploie synthétique Ca^{2 +}-indicateurs fluorescents, qui sont généralement livrés par le biais de l’électrode de patch pendant les enregistrements de cellules entières . Une méthode standard pour la quantification de Ca^{2 +} dynamique repose sur l’indicateur de double méthode^17,18. Il utilise deux fluorophores avec des spectres d’émission bien séparées (par exemple, une combinaison d’un rouge Ca^{2 +}-insensible colorant vert Ca^{2 +} indicateurs, tels que l’Oregon vert BAPTA-1 ou Fluo-4) et présente plusieurs avantages par rapport à la méthode de l’indicateur unique. Tout d’abord, un Ca^{2 +}-colorant insensible est utilisé pour localiser les petites structures d’intérêt (ramifications dendritiques et épines) où l’imagerie^{2 +} Ca sera effectuée. Deuxièmement, le rapport entre la variation de la fluorescence verte et rouge (ΔG/R) est calculé en guise de [Ca^{2 +}], qui est pratiquement insensible aux variations de fluorescence de base en raison de fluctuations [Ca^{2 +}]₀^{17 , 18}. en outre, les changements de fluorescence peuvent être calibrés en termes absolus, Ca^{2 +} concentration¹⁹.

Une préoccupation générale lors de l’exécution de deux photons Ca^{2 +} imageries expériences en tranches aiguës est la cellule santé et la stabilité de l’acquisition d’image en raison de la puissance du laser haute généralement utilisée. En outre, dans les^{2 +} expériences d’imagerie, de Ca on se préoccupe de la perturbation et l’importante surestimation de subcellulaire Ca^{2 +} dynamique dû au fait que servent d’indicateurs de Ca^{2 +} très mobiles exogène Ca^{2 +} mémoires tampons. Ainsi, le choix de l’indicateur de Ca^{2 +} et sa concentration dépend du type neuronal, l’amplitude attendue des chats et la question expérimentale.

Nous avons adapté la méthode biphotonique Ca^{2 +} imagerie pour recherche de Ca^{2 +} fluctuations de dendrites de GABAergique interneurones^{9,10,11,20,21 , 22}. alors que la majeure partie des premiers Ca^{2 +} études d’imagerie ont été effectuées dans les principaux neurones, interneurones inhibiteurs présenter une grande variété de mécanismes^{2 +} Ca fonctionnels qui sont distincts de ceux des cellules pyramidales^{20 , 23 , 24}. ces mécanismes interneurone spécifiques (par exemple, Ca^{2 +} perméables récepteurs AMPA) pourraient jouer un rôle spécifique dans la régulation de l’activité des cellules. Dendritiques Ca^{2 +} signalisation dans des interneurones est une cible tentante pour complément d’enquête, deux photons Ca^{2 +} imagerie dans les dendrites des cellules présente des difficultés supplémentaires, d’un diamètre plus mince des dendrites et manque d’épines pour une particulièrement élevé Ca^{2 +} liaison capacité endogène. Comme nos recherches portent sur l’étude des interneurones hippocampe, le protocole suivant, alors qu’il y a lieu à différentes populations de neurones, a été adapté pour faire face à ces défis.

Ce protocole a été exécuté avec un microscope confocal de deux photons commercial, qui était équipé de deux détecteurs externes, non-descanned (NDDS™), modulateur électro-optique (MOE) et un Dodt balayage dégradé contraste (CGT) et installé sur une table optique. Le microscope a été couplé avec un laser Ti : Sapphire de multiphoton mode bloqué à 800 nm (> 3 W, 140 impulsions fs, 80 Hz fréquence de répétition). Le système d’imagerie était équipé d’une plate-forme d’électrophysiologie standard, y compris une chambre de perfusion avec contrôle de température, une plateforme de traduction avec deux micromanipulateurs, un amplificateur de la microélectrode contrôlé par ordinateur, un numériseur, une stimulation appareil et logiciel d’acquisition de données.