Summary

レプトスピラトランスポゾン挿入変異体中に黄金シリアのハムスター感染の測定フィットネスにハイスループット並列配列

Published: December 18, 2017
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Summary

ここで高スループット シーケンス ハムスターの挑戦後トランスポゾン レプトスピラ突然変異体組織の定量化とトランスポゾン変異を組み合わせた手法について述べる。このプロトコルは、生存と動物の普及のため画面変異体に使え、生体外で研究にも適用することができます。

Abstract

本稿では,レプトスピラ変異ゴールデン ハムスター感染中フィットネスに変更の定量化 (Tn Seq) 手法をシーケンス トランスポゾンをについて説明します。Tn Seq は高スループット シーケンス技術の力とランダムなトランスポゾン変異を兼ね備えています。動物は収穫血液と組織の数日後、各器官 (出力プール) の突然変異体の数を定量化することによって続いてトランスポゾン変異体 (入力プール) のプールに立ち向かっています。出力のプールは、各変異体の生体内で適性を評価する入力のプールと比較されます。このアプローチにより、動物の限られた数の突然変異体の大規模なプールのスクリーニングです。マイナーな変更とレプトスピラ症の動物モデル、ラットなど貯留層ホスト モデルとの in vitro研究と同様、ハムスターなどの急性感染症モデルでこのプロトコルを実行できます。Tn Seq は、体内体外のフィットネス欠陥を持つ突然変異体の画面に強力なツールを提供します。

Introduction

遺伝学的ツールが利用可能な限られた数のため、レプトスピラなどのいくつかの細菌の病原性遺伝子の同定は難しい。一般的に使用される方法の 1 つは、各変異株における挿入部位の同定と病原性の動物モデルにおける個々 のトランスポゾン変異体のテストが続くランダムなトランスポゾン変異による変異体のコレクションの作成です。この方法は時間のかかる、高価なと多数の動物が必要です。

ランダム突然変異誘発はレプトスピラ病原体の開発当初、病原性に関与する遺伝子は動物モデル1に個々 の変異をテストによって識別されました。変異体は、その潜在的なシグナル伝達における役割または運動または予測外膜面の位置などの条件に基づいて選ばれました。レプトスピラの大半として遺伝子の未知関数2仮説蛋白質を符号化、選択する突然変異体は、これら条件制限に基づいて小説レプトスピラ病原性遺伝子を発見する能力。

最近では、 l. カバートランスポゾン変異体のプールは、ハムスターやマウスのモデル3の感染性の上映。各動物は、最大 10 の突然変異体のプールに挑戦しました。変異株の感染性は、それが血液や腎臓から得られる文化の PCR による検出された場合肯定的な得点されました。プールで各変異体の個々 の PCR 反応を必要とするため、PCR 検査は手間がかかっていました。文化各突然変異系統の周波数は定量化されていませんので、アプローチは高度弱毒化変異体の同定への試み偏っていた。

トランスポゾンの病原性遺伝子のスクリーニングより効率的にするための戦略として (Tn Seq) 手法をシーケンス処理について述べる.Tn seq は、大規模な並列シーケンス4,5,6続いてトランスポゾン変異による変異体のライブラリの作成で構成されます。簡単に言えば、トランスポゾン変異体がプール、動物に接種、さまざまな器官 (出力プール) が治った後。出力プールから DNA は抽出し、制限の酵素と消化されるか sonication によってせん断。PCR トランスポゾン挿入サイトの接合部の 2 つのラウンドが行われます。この手順は、シーケンスに必要なアダプターを追加をできます。結果として得られる PCR の製品は、各変異体変異体のプールの初期の組成と比較しての相対的な豊かさと共にプールのトランスポゾン挿入サイトを識別する高スループット シーケンスによって分析されます。

このアプローチの主な利点は、同時に数匹の動物の突然変異体の数が多いを選別する能力です。Tn Seq は新しいレプトスピラを発見のチャンスを高めるトランスポゾン挿入サイトの事前の知識を必要としない-より少ない時間と効率と病原性に関与する特定の遺伝子。致命的な影響を受けやすい感染組織におけるレプトスピラ負担が比較的高いため齧歯動物のモデル (通常 104 108細菌/g の組織に)7,8,9同様貯水池ホストのように10,11, 文化、生体外で成長に伴うバイアスを軽減することがなく直接組織を分析できます。

Tn Seq 日付に記載されているほとんどの細菌性病原体の研究で挿入の高周波はまとめて持つすべての遺伝子4 内の複数の密接に間隔トランスポゾン挿入変異体を含む大規模なプールで感染を許可 ,12,13,14。突然変異誘発頻度、程度の低い6細菌の Tn Seq も開発しました。レプトスピラとトランスポゾン変異体のライブラリは Slamti15のとおり活用によって子実プラスミド上のトランスポゾンを導入することで生成できます。しかし、 l. カバーのトランスポゾン誘発突然変異の頻度は低いです。受信者ごとの 10-8 x のみ 8.5 l. カバー16ライ株細胞とになりそうです transconjugant 周波数が報告されたHimar1トランスポゾンが接合性プラスミドを導入された、L. カバーの他のほとんどの株と同様に悪い。ここで説明されているプロトコルに基づいてボレリアブルグドルフェリ、トランスポゾン挿入変異の頻度が低い6ではまたのために開発される部分です。

と共に、低ひずみでトランスポゾン挿入変異体を分離することで他のグループの成功のためにl ・ カバー型 Manilae ひずみ L495 とトランスポゾン変異を実施しましたプロトコル17パイロット実験LD50 (致命的な線量) 病原性1。Tn Seq による 42 変異体をスクリーニングし、いくつかの突然変異体候補候補アデニル酸シクラーゼ遺伝子の 2 つの挿入を含む病原性の欠陥を識別しました。ハムスターの 2 つの突然変異体の個々 のテスト彼らは病原性17の欠乏だったことを確認しました。

Protocol

注意:レプトスピラ属菌の病原性系統は、バイオ セーフティ レベル 2 (BSL-2) 封じ込めプロシージャの下処理する必要があります。適切な個人用保護具 (PPE) を着用する必要があります。病原性レプトスピラのすべての操作に使用されるクラス II バイオ セーフティ キャビネット 1. トランスポゾンの創造変異ライブラリー15 トラ?…

Representative Results

活用によるl. カバーのトランスポゾン変異体のライブラリの作成では、図 1に示すように、ろ過装置が必要です。我々 はそれぞれの交配から 100-200 しかしながらを回復しました。 トランスポゾン挿入部位、各突然変異体におけるトランスポゾンの終わりをターゲットとする半ランダムな PCR に…

Discussion

Tn シーケンスによって突然変異体のより大きいプールを検査することを見込んでこの腹腔内 42 l. カバー変異挑戦のハムスターのためのパイロット実験からの結果は17を提示されて、しかしながらの頻度が低いので (100-200 しかしながら/交配)、いくつかの交配が大型の Tn Seq 実験の突然変異体の十分な数を生成する必要。液体培養変異体の大規模な数の維持の対処しな?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作業にベテラン事務功労賞 (D.A.H.) に支えられ、国立衛生研究所 (D.A.H.) に R01 AI 034431 を付与します。

Materials

Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus Sigma-Aldrich K4000
2,6-diaminopimelic acid Sigma-Aldrich D1377
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate Sigma-Aldrich S4014
Axio Lab A1 microscope with a darkfieldcondenser Zeiss 490950-001-000
DNeasy blood and tissue kit Qiagen 69504/69506
MinElute PCR Purification Qiagen 28004/28006
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104/28106
Model 505 Sonic Dismembrator Fisher Scientific FB-505
2.5" Cup horn Fisher Scientific FB-4625
Bead Ruptor 24 Omni International 19-010 Step 3.1.2.4
Terminal deoxynucleotidyl transferase Promega M828C
Master mix Phusion Thermo Scientific F531 Preparation of genomic libraries, step 3.4.
DreamTaq Master Mix Thermo Scientific K9011/K9012 Identification of the transposon insertion site, step 1.2.
dCTP Thermo Scientific R0151
ddCTP Affymetrix/ USBProducts 77112
T100 Thermal cycler BioRad 1861096
Qubit 2.0 fluorometer Invitrogen Q32866 step 3.6.
Qubit dsDNA HS assay kit Invitrogen Q32851/Q32854 step 3.6.
Qubit assay tubes life technologies Q32856 step 3.6.
PBS pH 7.2 (1X) Gibco 20012-027 20012-050
Disposable scalpel No10 Feather 2975#10
Plastic K2 EDTA 2 ml tubes BD vacutainer 367841
syringe U-100 with 26G x ½” needle BD vacutainer 329652 IP challenge, step 2.2.1.
3 mL Luer-Lok tip syringe BD vacutainer 309657 Cardiac puncture, step 2.4.2.
25G X 5/8” needle BD vacutainer 305901 Cardiac puncture, step 2.4.2.
25 mm fritted glass base with stopper EMD Millipore XX1002502 Filtration unit system, step 1.1.7.
25 mm aluminum spring clamp EMD Millipore XX1002503 Filtration unit system, step 1.1.7.
15 ml borosilcate glass funnel EMD Millipore XX1002514 Filtration unit system, step 1.1.7.
125 ml side-arm Erlenmeyer flask EMD Millipore XX1002505 Filtration unit system, step 1.1.7.
Acetate-cellulose filter VVPP (pore size 0.1 mm; diameter 25 mm) EMD Millipore VVLP02500

References

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Citer Cet Article
Lourdault, K., Matsunaga, J., Evangelista, K. V., Haake, D. A. High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection. J. Vis. Exp. (130), e56442, doi:10.3791/56442 (2017).

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