High throughput sequenziamento parallelo al Fitness misura di Leptospira interrogans trasposone inserimento mutanti durante dorato siriano criceto infezione

Identificazione di geni di virulenza per alcuni batteri, come ad esempio Leptospira spp., è difficile a causa del numero limitato di strumenti genetici disponibili. Un approccio comunemente utilizzato è la creazione di una collezione di mutanti di mutagenesi casuale trasposone seguita mediante l’identificazione del sito di inserimento in ogni mutante e virulenza prova di mutanti singoli trasposone in un modello animale. Questo approccio è che richiede tempo, costoso e richiede un gran numero di animali.

Quando mutagenesi casuale è stata sviluppata per l’agente patogeno Leptospira interrogans, sono stati identificati geni coinvolti nella virulenza di test singoli mutanti in un modello animale¹. Mutanti sono stati selezionati in base a criteri quali i loro ruoli potenziali nella segnalazione o motilità o loro membrana esterna prevista o posizione superficiale. Come la maggior parte dei lipopolosaccaridi geni codificano proteine ipotetiche di funzione sconosciuta², selezione di mutanti basato su questi limiti di criteri la possibilità di scoprire i geni di virulenza leptospirale romanzo.

Più recentemente, piscine di mutanti di L. interrogans trasposoni sono state schermate per infettività nei modelli criceto e mouse³. Ogni animale è stato sfidato con un pool di fino a 10 mutanti. Infettività di un mutante è stato segnato come positivo se è stato rilevato dalla PCR di colture ottenute da sangue e reni. Prova di PCR era laboriosa perché richiedeva una reazione di PCR individuale per ogni mutante in piscina. Perché la frequenza di ogni mutante nelle culture non è stata quantificata, l’approccio era prevenuto verso identificazione di mutanti altamente attenuati.

Descriviamo un trasposone sequenziamento (Tn-Seq) tecnica, come strategia per schermo in modo più efficiente per i geni di virulenza. TN-seq è costituito dalla creazione di una libreria di mutanti mediante mutagenesi transposon seguita da sequenziamento massivo parallelo^4,5,6. Brevemente, trasposoni mutanti sono riuniti, inoculati in animali e poi recuperati da diversi organi (uscita piscine). Il DNA dalle piscine uscita è estratta e digerito con enzimi di restrizione o Tosato di sonicazione. Vengono eseguiti due cicli di PCR targeting per le giunzioni dei siti inserimento trasposoni. Questo passaggio consente di aggiungere gli adattatori necessari per il sequenziamento. I prodotti PCR ottenuti sono analizzati dall’ordinamento ad alta produttività per identificare il sito di inserzione del trasposone di ogni mutante della piscina insieme a loro abbondanza relativa, che è rispetto alla composizione iniziale della piscina del mutante.

Il vantaggio principale di questo approccio è la capacità di schermo simultaneamente un gran numero di mutanti con un numero limitato di animali. TN-Seq non richiede la conoscenza dei siti inserimento trasposone che aumenta le possibilità di scoprire nuove Leptospira-geni specifici coinvolti nella virulenza con meno tempo e una maggiore efficienza. Perché leptospirale onere nei tessuti è relativamente alto in roditore modelli suscettibili di letale infezione (tipicamente 10⁴ -10⁸ batteri/g di tessuto)^7,8,9 pure come padroni di casa serbatoio ^10,11, tessuti possono essere analizzati direttamente senza la necessità di cultura, riducendo le distorsioni a causa della crescita in vitro .

Negli studi di Tn-Seq con maggior parte dei batteri patogeni descritti fin qui, l’alta frequenza di mutagenesi inserzionale ammessi infezione con grandi vasche contenenti mutanti collettivamente avendo più inserimenti trasposone ravvicinate all’interno di ogni gene^{4 ,12,13,14}. TN-Seq è stato sviluppato anche per un batterio per cui la frequenza di mutagenesi è molto inferiore⁶. Con Leptospira, una libreria di mutanti trasposone può essere generata introducendo il trasposone su un plasmide che possono essere mobilitato da coniugazione come descritto da Slamti et al.¹⁵. Tuttavia, la frequenza di mutagenesi transposon di L. interrogans è bassa. Quando il trasposone Himar1 è stato introdotto su un plasmide coniugativi, la frequenza di transconjugant è stata segnalata per essere solo 8,5 x 10^-8 per ogni destinatario delle cellule con il ceppo di Lai di L. interrogans¹⁶ e rischia di essere allo stesso modo scarsa con la maggior parte altri ceppi di L. interrogans. Il protocollo descritto qui è in parte basato su quello sviluppato per Borrelia burgdorferi, in cui la frequenza di mutagenesi inserzionale trasposone è anche basso⁶.

Per il nostro esperimento pilota con il protocollo¹⁷, abbiamo condotto la mutagenesi transposon con L. interrogans serovar Manilae ceppo L495 a causa del successo di altri gruppi ad isolare mutanti di inserimento trasposone nel ceppo insieme al suo basso LD₅₀ (dose letale) per virulenza¹. Abbiamo proiettato 42 mutanti di Tn-Seq e identificato parecchi candidati mutanti difettosi nella virulenza, compreso due con inserimenti in un gene di adenilato ciclasi del candidato. Prova individuale dei due mutanti in criceti ha confermato che erano carenti in virulenza¹⁷.