Hochdurchsatz-parallele Sequenzierung Maßnahme Fitness Leptospira Interrogans Transposon Insertion Mutanten während Golden syrischen Hamster Infektion

Identifizierung von Genen Virulenz für manche Bakterien, wie z. B. Leptospira spp., ist schwierig, wegen der begrenzten Zahl der genetischen Werkzeuge zur Verfügung. Eine häufig verwendete Methode ist die Erstellung einer Sammlung von Mutanten durch zufällige Transposon Mutagenese, gefolgt von der Identifikation der Insertionsstelle in jeder Mutant und Virulenz von einzelnen Transposon Mutanten in einem Tiermodell testen. Dieser Ansatz ist zeitaufwendig, teuer und erfordert eine große Anzahl von Tieren.

Als zufällige Mutagenese zunächst für den Erreger Leptospira Interrogansentwickelt wurde, wurden an Virulenz beteiligten Gene identifiziert, durch die Prüfung einzelner Mutanten in einem Tiermodell¹. Mutanten wurden basierend auf Kriterien wie ihre mögliche Rolle bei der Signalisierung oder Motilität oder ihrer vorhergesagten Außenmembran oder Oberfläche Speicherort ausgewählt. Da die Mehrzahl der Leptospiral Gene kodieren hypothetischen Proteine der unbekannten Funktion², Auswahl durch Mutation entstehende Variationen anhand dieser Kriterien Grenzen die Möglichkeit, neuartige Leptospiral Virulenz Gene zu entdecken.

Pools von L. Interrogans Transposon Mutanten wurden in jüngerer Zeit, für die Infektiosität in der Hamster und Maus Modelle³gezeigt. Jedes Tier wurde mit einem Pool von bis zu 10 Mutanten in Frage gestellt. Infektiosität einer Mutante erzielte er als positiv, wenn sie durch PCR Kulturen gewonnenen Blut und Niere festgestellt worden. PCR-Tests war mühsam, weil es eine individuelle PCR-Reaktion für jede Mutante im Pool erforderlich. Da die Frequenz jeder Mutant in den Kulturen nicht quantifiziert wurde, war der Ansatz zur Identifizierung von stark abgeschwächte Mutanten voreingenommen.

Wir beschreiben ein Transposon Sequenzierung (Tn-Seq) Technik, als eine Strategie, um effizienter Bildschirm für Virulenz Gene. TN-Seq besteht aus der Erstellung einer Bibliothek von Mutanten durch Transposon Mutagenese gefolgt von massiven parallelen Sequenzierung^4,5,6. Transposon Mutanten sind kurz, gebündelt, in die Tiere geimpft und später erholte sich von verschiedenen Organen (Ausgabe Pools). Die DNA von den Ausgabe-Pools wird extrahiert und mit Restriktionsenzymen verdaut oder durch Ultraschallbehandlung geschert. Zwei Runden von PCR gezielt die Kreuzungen der Transposon Einfügung Seiten erfolgen. Dieser Schritt ermöglicht die Zugabe von den Adaptern für die Sequenzierung erforderlich. Die daraus resultierende PCR-Produkte werden von Hochdurchsatz-Sequenzierung Transposon Insertionsstelle jede Mutante des Pools zusammen mit ihrer relativen Fülle, zu identifizieren, die im Vergleich zu der ursprünglichen Zusammensetzung der Pool der Mutant analysiert.

Der Hauptvorteil dieses Ansatzes ist die Fähigkeit, gleichzeitig eine große Anzahl von Mutanten mit einer kleinen Anzahl von Tieren auf den Bildschirm. TN-Seq erfordert keine Vorkenntnisse der Transposon Einfügung Websites die erhöht die Chancen der Entdeckung neuer Leptospiren-spezifischen Genen in Virulenz mit weniger Zeit und mehr Effizienz. Weil Leptospiral Belastung im Gewebe relativ hoch in Nagetier-Modelle anfällig für tödliche Infektion (in der Regel 10⁴ 10⁸ Bakterien/g Gewebe)^7,8,9 ebenso wie Reservoirwirten ^10,11, Gewebe direkt analysiert werden können, ohne die Notwendigkeit, Kultur, Verringerung der Verzerrungen durch in-vitro- Wachstum.

In Tn-Seq-Studien mit den meisten bakteriellen Erregern, die bisher beschrieben erlaubt die hohe Frequenz der insertional Mutagenese Infektion mit großen Pools mit Mutanten, die gemeinsam mit mehreren eng beieinander liegender Transposon Einfügungen innerhalb jedes Gen^{4 ,12,13,14}. TN-Seq wurde auch für ein Bakterium entwickelt für die Mutagenese-Frequenz viel niedriger^{6 ist}. Mit Leptospirakann eine Bibliothek von Transposon Mutanten erzeugt werden, durch die Einführung des Transposons auf ein konduktiven Plasmid durch Konjugation wie von Slamti Et Al¹⁵beschrieben. Die Häufigkeit der Transposon Mutagenese von L. Interrogans ist jedoch gering. Wenn das Transposon Himar1 auf ein konjugative Plasmid eingeführt wurde, wurde die Transconjugant Häufigkeit berichtet, nur 8,5 x 10^-8 pro Empfänger mit der Lai-Belastung von L. Interrogans¹⁶ Zelle und wird voraussichtlich ähnlich schlecht mit den meisten anderen Sorten von L. Interrogans. Das hier beschriebene Protokoll ist im Teil auf der Grundlage, die für Borrelia Burgdorferi, entwickelt in denen die Häufigkeit von Transposon insertional Mutagenese ist auch niedrig⁶.

Für unsere Pilotversuch mit der Protokoll-¹⁷führten wir Transposon Mutagenese mit L. Interrogans Serovar Manilae Stamm L495 aufgrund des Erfolges der anderen Gruppen isolieren Transposon Einfügung Mutanten in den Stamm zusammen mit seinem tief LD₅₀ (letale Dosis) für Virulenz¹. Wir 42 Mutanten durch Tn-Seq abgeschirmt und identifiziert mehrere mutierte Kandidaten in Virulenz, darunter zwei mit Einfügungen in einem Kandidaten-Adenylat-Cyclase-gen defekt. Einzelprüfung der beiden Mutanten in Hamster bestätigt, dass sie einen Mangel an Virulenz¹⁷waren.