Summary

Generación de Integración libres de células madre pluripotentes inducidas a partir de células mononucleares de sangre periférica humana Utilizando vectores episomales

Published: January 01, 2017
doi:

Summary

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

Abstract

Células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) son una gran promesa para el modelado de la enfermedad y las terapias regenerativas. Hemos informado anteriormente el uso de vectores episomales (EV) para generar células iPS sin integración a partir de células mononucleares de sangre periférica (PB CMN). Los vectores episomales utilizados son plásmidos de ADN incorporados con elementos oriP y EBNA1 del virus Epstein-Barr (EB), que permiten la replicación y largo plazo Contención de plásmidos en células de mamífero, respectivamente. Con una optimización adicional, miles de colonias IPSC se pueden obtener a partir de 1 ml de sangre periférica. Dos factores críticos para lograr altas eficiencias de reprogramación son: 1) el uso de un 2A "auto-división" péptido para enlazar Oct4 y Sox2, logrando de esta manera la expresión equimolar de los dos factores; 2) el uso de dos vectores para expresar MYC y KLF4 individualmente. Aquí se describe un protocolo paso a paso para la generación libre de integración de IPSC a partir de muestras de sangre periférica de adultos. Las células iPS generadas están libres de integración como plásmidos episomales residuales son indetectables después de cinco pasajes. Aunque la eficiencia de reprogramación es comparable a la de Virus Sendai vectores (SV), plásmidos EV son considerablemente más económico que los vectores SV disponibles comercialmente. Este sistema EV reprogramación asequible tiene potencial para aplicaciones clínicas en medicina regenerativa y ofrece un enfoque para la reprogramación directa de las multinacionales del PP a las células libres de integración madre mesenquimales, células madre neurales, etc.

Introduction

Después de la expresión forzada de varios factores de transcripción (Es decir, Oct4, Sox2, MYC y KLF4), las células somáticas pueden ser reprogramadas para células madre pluripotentes inducidas (iPSCs), los cuales son muy prometedores para aplicaciones en la medicina regenerativa y la terapia de reemplazo celular 1-3. Hasta la fecha, diversos métodos han sido desarrollados para aumentar la tasa de éxito de la reprogramación de 4-7. Los vectores virales reprogramación inducida es ampliamente utilizado para la generación eficiente de células iPS, debido a la integración viral conduce a un alto nivel, la expresión estable de los factores de reprogramación. Sin embargo, la integración permanente del vector de ADN en el genoma de la célula puede inducir la mutagénesis de inserción 5. Además, la falta de inactivación de los factores de reprogramación puede perturbar la diferenciación iPSCs 8. Como tal, el uso de iPSCs sin la integración de factores de reprogramación es imprescindible, especialmente para uso en aplicaciones de terapia celular.

<p class="jove_content"> Vectores episomales (EVs) son ampliamente utilizados en la generación de iPSCs sin integración. El EV más comúnmente utilizado es un plásmido que contiene dos elementos, origen de replicación viral (oriP) y EB antígeno nuclear 1 (EBNA1), por el virus de Epstein-Barr (EB) 9. El elemento oriP promueve la replicación del plásmido en células de mamífero, mientras que el elemento EBNA1 ata el plásmido de ADN que contiene oriP-al ADN cromosómico que permite la compartimentación del episoma durante la división de la célula huésped. En comparación con otros enfoques libre de integración, incluyendo el virus Sendai (SV) y el ARN de la transfección, los vehículos eléctricos poseen múltiples ventajas 5,6,10. Como ADN plásmido, los vehículos eléctricos se pueden producir fácilmente y modificados en la casa, que les hace extremadamente asequible. Además, la reprogramación con EV es un proceso menos laborioso ya que una única transfección con los vehículos eléctricos es suficiente para la generación de IPSC, mientras que varios transfecciones de ARN son necesarias para la reprogramación éxito.

refibroblastos ermal se han utilizado en muchos estudios de reprogramación. Sin embargo, la biopsia de piel no sólo es un proceso invasivo y doloroso, pero también consume mucho tiempo para la expansión de las células a cantidades suficientes para la reprogramación. De mayor preocupación, células de la piel de donantes adultos a menudo han sido expuestos a la radiación de luz UV a largo plazo, lo que puede dar lugar a mutaciones asociadas a tumores, lo que limita las solicitudes de células iPS derivadas de fibroblastos de la piel 11,12. Recientemente, se ha informado de que las células de la piel humana normal se acumulan mutaciones somáticas y múltiples genes del cáncer, incluyendo la mayor parte de los principales impulsores de los carcinomas de células escamosas cutáneas, están bajo fuerte selección positiva 13.

En contraste con los fibroblastos de piel, células de la sangre periférica (PB) son una fuente preferida de células para la reprogramación porque 1) células sanguíneas se pueden obtener fácilmente a través de un proceso mínimamente invasivo, 2) células de sangre periférica son la progenie de las células madre hematopoyéticasque residen en la médula ósea, por lo tanto protegido de la radiación dañina. Las células mononucleares de sangre periférica (PB CMN) se pueden recoger en una hora de la capa leucocitaria tras un simple centrifugación en gradiente de Ficoll-Hypaque (1,077 g / ml). Las MNCs PB obtenidos se componen de linfocitos, monocitos y unas pocas células progenitoras hematopoyéticas (HPC) 14. Aunque los linfocitos T humanos son uno de los principales tipos de células en PB, células T maduras contienen reordenamientos del receptor de células T (TCR) genes y carecen de un genoma intacto que limita su potencial para aplicaciones 15,16. Sin embargo, el rejuvenecimiento de las células T a través de la generación de IPSC puede tener aplicaciones potenciales en quimérico Receptor de Antígeno (CAR), la terapia de células T 17-19. En comparación, HPC tiene un genoma intacto y son fácilmente reprogramables. Aunque sólo 0,01-0,1% de células en la circulación periférica son HPCs, estas células se pueden expandir ex vivo en un medio de eritroides que favorece la proliferación de erythrcélulas progenitoras oid 14.

En nuestro estudio anterior, se utilizó el factor de BCL-XL además de los factores Yamanaka (Oct4, Sox2, MYC y KLF4), lo que resultó en un aumento de 10 veces en PB eficiencia de reprogramación 20. BCL-XL, también conocido como Bcl2l1, es un potente inhibidor de la muerte celular, inhibiendo la activación de las caspasas 21,22. Pero, BCL-XL también puede desempeñar un papel importante en el mantenimiento de la pluripotencia 21,22. Recientemente, hemos optimizado nuestro sistema EV reprogramación expresando separado MYC y KLF4 con dos vectores, lo que conduce a un aumento de aproximadamente 100 veces en la eficiencia de reprogramación 23. Usando este método, la eficiencia de reprogramación, definido por el número de colonias a partir dividido por el número de células en la transfección, es desde 0,2 hasta 0,5% de donantes sanos. En la siguiente manera, se describe el procedimiento experimental detallado para la generación de células iPS sin integración de PB.

Protocol

Todas las muestras de PB humanos se obtuvieron de donantes adultos anónimos que no tienen información de identificación disponible de Tianjin Centro de Sangre con la aprobación del comité local de ética de investigación. 1. Endo-libre plásmido Preparación Utilizar un kit de purificación de plásmidos Maxi comercial para extraer vectores episomales de E. coli según el protocolo del fabricante. Para la etapa final, tampón TE sustituto con agua estéril libre de …

Representative Results

El uso de este protocolo, podemos obtener cientos de colonias de 1 x 10 5 nucleofected PB MNC (Figuras 1A y 1B). La eficiencia de reprogramación es de aproximadamente 0,2 a 0,5% y las colonias expresan marcadores de pluripotencia (Figuras 1C y 1D). iPSCs generadas utilizando el protocolo descrito están libres de integración y tienen la capacidad de formar teratoma componer las 3 capas germinales (Fi…

Discussion

La adquisición de las muestras de sangre de donantes sanos o pacientes es conveniente y no invasivo, lo que es una fuente de células atractiva para la investigación básica y clínica de terapia celular. Aquí hemos descrito un protocolo para la generación altamente eficiente de iPSCs libre de integración a partir de muestras de sangre periférica. Este enfoque reproducible y asequible debería beneficiar al campo de IPSC.

Hemos informado que hay dos factores críticos responsables de l…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Ministry of Science and Technology of China (2015CB964902, 2013CB966902 and 2012CB966601), the National Natural Science Foundation of China (81500148, 81570164 and 81421002), the Loma Linda University School of Medicine GCAT grant (2015), and Telemedicine and Advanced Technology Research Center (W81XWH-08-1-0697).

Materials

Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium Sigma S0192 Store at 4 °C
Human stem cell factor (SCF) Peprotech 300-07 Store at -20 or -80°C
Interleukin-3 (IL-3) Peprotech AF-200-03 Store at -20 or -80°C
Eryrthropoietin (EPO) Peprotech 100-64 Store at -20 or -80°C
Insulin growth factor-1 (IGF-1) Peprotech 100-11 Store at -20 or -80°C
Dexamethasone Sigma D4902 Store at -20 or -80°C
1-thioglycerol (MTG) Sigma M6145 Store at -20 or -80°C
DMEM/F12 medium Gibco 112660-012 Store at 4 °C
L-glutamine (100x) Gibco 25030-081 Store at -20 °C
Penicillin/Streptomycin (100x) Gibco 15140-122 Store at -20 °C
Non-essential amino acids solution (100x) Gibco 11140-050 Store at 4 °C
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) Peprotech 100-18B Store at -20 or -80°C
ITS (100x) Gibco 41400-045 Store at 4 °C
Ascorbic acid Sigma 49752 Store at -20 °C
DMEM (high glucose) medium Thermo SH30243.01B Store at 4 °C
FBS Hyclone SV30087.01 Store at -40 °C
Ficoll GE Healthcare, SIGMA 17-5442-02 Store at RT
Trehalose  Sigma T9531 Store at 4 °C
DMSO Sigma D2650 Store at RT, protect from light
Endofree Plasmid Maxi Kit(10) Qiagen 12362 Store at RT
IMDM Gibco 21056-023 Store at 4 °C
Human CD34+ Cell Nucleofection Kit Lonza VPA-1003 Store at RT, nucleofection buffer and supplement buffer should be stored at 4 °C
Sodium butyrate Sigma B5887 Store at -20 or -80°C
ROCK inhibitor Y27632 STEMGENT 04-0012-10 Store at -20 °C
Essential 8 basal medium (E8) Gibco A15169-01 Store at 4 °C, the supplement should be stored at -20 or -80°C
Matrigel BD 354277 Store at -20 or -80°C
2x EasyTaq PCR SuperMix(+dye) TransGen Biotech AS111 Store at -20 °C
Cell detachment solution STEMGENT 01-0006 Store at -20 °C, Accutase as a cell detachment solution to obtain a single cell suspension
DAPI Sigma D9542-1MG Store at 4 °C or -20 °C
Anti-nanog-AF488 BD 560791 Store at 4 °C, primary antibody used for Immunofluorescence, dilute 1/100 when use
Anti-OCT4 abcam ab19857 Store at 4 °C, primary antibody used for Immunofluorescence, dilute 1/100 when use
AF488 donkey anti-mouse IgG Invitrogen A21202 Store at 4 °C, secondary antibody used for Immunofluorescence,  dilute 1/500 when use
PE anti-human TRA-1-60-R Antibody Biolegend 330610 Store at 4 °C, antibody used for flow cytometry
eFluor 570-conjugated anti-SSEA4 eBioscience 41-8843 Store at 4 °C, antibody used for flow cytometry
Isotype antibody eBioscience 11-4011 Store at 4 °C, antibody used for flow cytometry
Alkaline Phosphatase Detection Kit SiDanSai 1102-100 Store at 4 °C
Genomic DNA Extraction Kit TIANGEN DP304-02 Store at RT
Trypan Blue solution Sigma T8154 Store at RT
Flow cytometry cell analyzer BD LSRII for flow cytometry analysis
Spinning disk confocal microscope (SDC) PerkinElmer UltraVIEW VOX for confocal imaging
Nucleofection device Lonza Nucleofector 2b for the nucleofection of PB MNC
ImageQuant LAS-4010 GE take photo of AP staining in bulk

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Citer Cet Article
Wen, W., Zhang, J., Chen, W., Arakaki, C., Li, X., Baylink, D., Botimer, G. D., Xu, J., Yuan, W., Cheng, T., Zhang, X. Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors. J. Vis. Exp. (119), e55091, doi:10.3791/55091 (2017).

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