Generazione di integrazione-liberi cellule staminali pluripotenti indotte dalle cellule mononucleari di sangue periferico umano Utilizzando episomiale Vettori

Dopo forzata espressione di diversi fattori di trascrizione (Cioè OCT4, SOX2, MYC e Klf4), cellule somatiche possono essere riprogrammate a cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs), che detengono una grande promessa per applicazioni in medicina rigenerativa e terapia di sostituzione cellulare ^1-3. Fino ad oggi, diversi metodi sono stati sviluppati per aumentare il tasso di successo della riprogrammazione ^4-7. Vettori virali indotta riprogrammazione è ampiamente utilizzato per la generazione efficiente di iPSCs, perché l'integrazione virale porta ad un alto livello, espressione stabile dei fattori di riprogrammazione. Tuttavia, l'integrazione permanente del DNA del vettore nel genoma della cellula può indurre mutagenesi inserzionale ^5. Inoltre, insufficiente inattivazione dei fattori di riprogrammazione può disturbare iPSCs differenziazione ^8. Come tale, l'uso di iPSCs senza integrazione dei fattori di riprogrammazione è indispensabile, in particolare per l'uso in applicazioni di terapia cellulare.

<p class="jove_content"> Episomiale Vettori (EV) sono ampiamente utilizzati nella generazione di iPSCs senza integrazione. L'EV più comunemente usato è un plasmide contenente due elementi, origine di replicazione virale (oriP) e EB antigene nucleare 1 (EBNA1), del virus di Epstein-Barr ⁹ (EB). L'elemento oriP promuove la replicazione del plasmide in cellule di mammifero, mentre l'elemento EBNA1 Tethers plasmide DNA oriP contenente il DNA cromosomico che consente la compartimentazione del episoma durante la divisione della cellula ospite. In confronto ad altri approcci privi di integrazione, tra cui Sendai Virus (SV) e RNA trasfezione, i veicoli elettrici in possesso di molteplici vantaggi ^5,6,10. Come il DNA plasmide, i veicoli elettrici possono essere facilmente realizzati e modificati in casa, che li rende estremamente conveniente. Inoltre, riprogrammando con EV è un processo meno alta intensità di lavoro da un unico trasfezione con veicoli elettrici è sufficiente per la generazione di IPSC, che sono necessarie per la riprogrammazione di successo diversi trasfezioni RNA.

Dfibroblasti ermal sono stati utilizzati in molti studi di riprogrammazione. Tuttavia, la biopsia della pelle non è solo un processo invasivo e doloroso, ma anche in termini di tempo per l'espansione delle cellule a quantità sufficienti per la riprogrammazione. Di maggiore preoccupazione, le cellule della pelle di donatori adulti sono stati spesso esposti a radiazioni UV-lungo termine, che può portare a mutazioni associate a tumori, limitando così le domande di iPSCs derivate da fibroblasti cutanei ^11,12. Recentemente, è stato riportato che le normali cellule della pelle umana si accumulano mutazioni somatiche e molteplici geni del cancro, tra cui la maggior parte dei fattori chiave della cutanee carcinomi a cellule squamose, sono sotto forte selezione positiva ^13.

In contrasto con i fibroblasti della pelle, sangue periferico (PB), le cellule sono una fonte di cellule preferibili per la riprogrammazione perché 1) le cellule del sangue possono essere facilmente ottenute attraverso un processo minimamente invasiva, 2), le cellule del sangue periferico sono la progenie di cellule staminali ematopoieticheresidente nel midollo osseo, quindi protetto dalle radiazioni nocive. cellule mononucleate del sangue periferico (PB MNC) possono essere raccolti in un'ora dallo strato buffy coat a seguito di una semplice centrifugazione in gradiente utilizzando Ficoll-Hypaque (1.077 g / mL). Le multinazionali PB ottenuti sono composti da linfociti, monociti e un paio di cellule progenitrici ematopoietiche (HPC) ^14. Sebbene linfociti T umani sono uno dei principali tipi di cellule in PB, maturo cellule T contengono riarrangiamenti del recettore delle cellule T (TCR) geni e mancano di un genoma intatto limitando così il loro potenziale per applicazioni ^15,16. Tuttavia, il ringiovanimento delle cellule T attraverso generazione iPSC può avere potenziali applicazioni in chimerico Antigen Receptor (CAR) Terapia cellule T ^17-19. In confronto, HPC hanno un genoma intatto e sono facilmente riprogrammabile. Anche se solo 0,01-0,1% in cellule circolazione periferica sono HPC, queste cellule possono essere espanse ex vivo in media eritroide che favorisce la proliferazione di erythrcellule progenitrici OID ^14.

Nel nostro studio precedente, abbiamo usato il fattore BCL-XL in aggiunta ai fattori di Yamanaka (OCT4, SOX2, MYC e Klf4), che ha provocato un aumento di 10 volte in PB riprogrammazione efficienza ^20. BCL-XL, noto anche come BCL2L1, è un potente inibitore di morte cellulare, inibendo l'attivazione delle caspasi ^21,22. Ma, BCL-XL può anche svolgere un ruolo importante nel mantenimento della pluripotenza ^21,22. Recentemente, abbiamo ulteriormente ottimizzato il nostro sistema EV riprogrammazione esprimendo separatamente MYC e Klf4 con due vettori, che porta a un aumento di circa 100x in efficienza riprogrammazione ^23. Utilizzando questo metodo, l'efficienza riprogrammazione, definito dal numero di colonie diviso per numero iniziale di cellule a transfezione, è di 0,2 – 0,5% da donatori sani. Come segue, si descrive la procedura sperimentale dettagliato per la generazione di iPSCs senza integrazione da PB.