Generación de Integración libres de células madre pluripotentes inducidas a partir de células mononucleares de sangre periférica humana Utilizando vectores episomales

Después de la expresión forzada de varios factores de transcripción (Es decir, Oct4, Sox2, MYC y KLF4), las células somáticas pueden ser reprogramadas para células madre pluripotentes inducidas (iPSCs), los cuales son muy prometedores para aplicaciones en la medicina regenerativa y la terapia de reemplazo celular ^1-3. Hasta la fecha, diversos métodos han sido desarrollados para aumentar la tasa de éxito de la reprogramación de ^4-7. Los vectores virales reprogramación inducida es ampliamente utilizado para la generación eficiente de células iPS, debido a la integración viral conduce a un alto nivel, la expresión estable de los factores de reprogramación. Sin embargo, la integración permanente del vector de ADN en el genoma de la célula puede inducir la mutagénesis de inserción ^5. Además, la falta de inactivación de los factores de reprogramación puede perturbar la diferenciación iPSCs ^8. Como tal, el uso de iPSCs sin la integración de factores de reprogramación es imprescindible, especialmente para uso en aplicaciones de terapia celular.

<p class="jove_content"> Vectores episomales (EVs) son ampliamente utilizados en la generación de iPSCs sin integración. El EV más comúnmente utilizado es un plásmido que contiene dos elementos, origen de replicación viral (oriP) y EB antígeno nuclear 1 (EBNA1), por el virus de Epstein-Barr (EB) ^9. El elemento oriP promueve la replicación del plásmido en células de mamífero, mientras que el elemento EBNA1 ata el plásmido de ADN que contiene oriP-al ADN cromosómico que permite la compartimentación del episoma durante la división de la célula huésped. En comparación con otros enfoques libre de integración, incluyendo el virus Sendai (SV) y el ARN de la transfección, los vehículos eléctricos poseen múltiples ventajas ^5,6,10. Como ADN plásmido, los vehículos eléctricos se pueden producir fácilmente y modificados en la casa, que les hace extremadamente asequible. Además, la reprogramación con EV es un proceso menos laborioso ya que una única transfección con los vehículos eléctricos es suficiente para la generación de IPSC, mientras que varios transfecciones de ARN son necesarias para la reprogramación éxito.

refibroblastos ermal se han utilizado en muchos estudios de reprogramación. Sin embargo, la biopsia de piel no sólo es un proceso invasivo y doloroso, pero también consume mucho tiempo para la expansión de las células a cantidades suficientes para la reprogramación. De mayor preocupación, células de la piel de donantes adultos a menudo han sido expuestos a la radiación de luz UV a largo plazo, lo que puede dar lugar a mutaciones asociadas a tumores, lo que limita las solicitudes de células iPS derivadas de fibroblastos de la piel ^11,12. Recientemente, se ha informado de que las células de la piel humana normal se acumulan mutaciones somáticas y múltiples genes del cáncer, incluyendo la mayor parte de los principales impulsores de los carcinomas de células escamosas cutáneas, están bajo fuerte selección positiva ^13.

En contraste con los fibroblastos de piel, células de la sangre periférica (PB) son una fuente preferida de células para la reprogramación porque 1) células sanguíneas se pueden obtener fácilmente a través de un proceso mínimamente invasivo, 2) células de sangre periférica son la progenie de las células madre hematopoyéticasque residen en la médula ósea, por lo tanto protegido de la radiación dañina. Las células mononucleares de sangre periférica (PB CMN) se pueden recoger en una hora de la capa leucocitaria tras un simple centrifugación en gradiente de Ficoll-Hypaque (1,077 g / ml). Las MNCs PB obtenidos se componen de linfocitos, monocitos y unas pocas células progenitoras hematopoyéticas (HPC) ^14. Aunque los linfocitos T humanos son uno de los principales tipos de células en PB, células T maduras contienen reordenamientos del receptor de células T (TCR) genes y carecen de un genoma intacto que limita su potencial para aplicaciones ^15,16. Sin embargo, el rejuvenecimiento de las células T a través de la generación de IPSC puede tener aplicaciones potenciales en quimérico Receptor de Antígeno (CAR), la terapia de células T ^17-19. En comparación, HPC tiene un genoma intacto y son fácilmente reprogramables. Aunque sólo 0,01-0,1% de células en la circulación periférica son HPCs, estas células se pueden expandir ex vivo en un medio de eritroides que favorece la proliferación de erythrcélulas progenitoras oid ^14.

En nuestro estudio anterior, se utilizó el factor de BCL-XL además de los factores Yamanaka (Oct4, Sox2, MYC y KLF4), lo que resultó en un aumento de 10 veces en PB eficiencia de reprogramación ^20. BCL-XL, también conocido como Bcl2l1, es un potente inhibidor de la muerte celular, inhibiendo la activación de las caspasas ^21,22. Pero, BCL-XL también puede desempeñar un papel importante en el mantenimiento de la pluripotencia ^21,22. Recientemente, hemos optimizado nuestro sistema EV reprogramación expresando separado MYC y KLF4 con dos vectores, lo que conduce a un aumento de aproximadamente 100 veces en la eficiencia de reprogramación ^23. Usando este método, la eficiencia de reprogramación, definido por el número de colonias a partir dividido por el número de células en la transfección, es desde 0,2 hasta 0,5% de donantes sanos. En la siguiente manera, se describe el procedimiento experimental detallado para la generación de células iPS sin integración de PB.