Generatie van Integratie-free geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke perifere mononucleaire bloedcellen behulp Episomaal Vectors

Na het gedwongen expressie van een aantal transcriptiefactoren (Dwz OCT4, SOX2, MYC en KLF4), kunnen somatische cellen worden geherprogrammeerd tot geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs), die een grote belofte voor toepassingen in regeneratieve geneeskunde en celvervangingstherapie ^1-3 te houden. Tot op heden zijn verschillende werkwijzen ontwikkeld om het succes van herprogrammering ^4-7 te verhogen. Virale vectoren geïnduceerde herprogrammering wordt veel gebruikt voor efficiënte generatie iPSC omdat virale integratie leidt tot een hoog niveau, stabiele expressie van de herprogrammering factoren. Echter kan permanente integratie van het vector DNA in het genoom insertie mutagenese ⁵ induceren. Bovendien kan onvoldoende inactivering van herprogrammering factoren iPSC differentiatie ⁸ verstoren. Als zodanig is het gebruik van iPSCs zonder integratie van herprogrammering factoren is noodzakelijk, met name voor toepassing bij celtherapie toepassingen.

<p class="jove_content"> Episomaal Vectors (EV) worden veel gebruikt bij het genereren van integratie-vrije iPSCs. De meest gebruikte EV is een plasmide dat twee elementen, oorsprong van virale replicatie (oriP) en EB Nuclear Antigen 1 (EBNA1), van het Epstein-Barr (EB) -virus ^9. De oriP element bevordert plasmide replicatie in zoogdiercellen, terwijl de EBNA1 element aanbinden de oriP-bevattende plasmide-DNA aan het chromosomale DNA dat zorgt voor de verdeling van de episoom bij deling van de gastheercel. In vergelijking met andere integratie-vrij benaderingen, waaronder Sendai virus (SV) en RNA transfectie EV bezitten meerdere voordelen ^5,6,10. Zoals plasmide-DNA, kunnen EV's gemakkelijk worden geproduceerd en gewijzigd in huis, waardoor ze zeer betaalbaar. Bovendien herprogrammering met EV is minder arbeidsintensief proces aangezien een enkele transfectie met EV volstaat iPSC productie, terwijl verschillende RNA transfecties nodig voor een succesvolle herprogrammering zijn.

DErmal fibroblasten werden gebruikt in vele studies herprogrammering. Echter, huidbiopsie is niet alleen een invasieve en pijnlijk proces, maar ook tijdrovend voor uitbreiding cellen voldoende hoeveelheden herprogrammering. Van groter belang zijn huidcellen van volwassen donoren vaak blootgesteld aan langdurige UV-straling, hetgeen kan leiden tot mutaties geassocieerd met tumoren, waardoor de verzoeken om iPSCs afgeleid van huidfibroblasten ^11,12 beperken. Onlangs is vermeld dat normale menselijke huidcellen ophopen somatische mutaties en meerdere kankergenen, waaronder de meeste van de drijvende krachten cutane plaveiselcelcarcinomen, onder sterke positieve selectie ^13.

In tegenstelling tot huidfibroblasten, perifeer bloed (PB) cellen een voorkeur bron van cellen voor herprogrammering omdat 1) bloedcellen gemakkelijk door een minimaal invasieve werkwijze kunnen worden verkregen, 2) perifere bloedcellen zijn het nageslacht van hematopoietische stamcellenwonende in het beenmerg, dus beschermd tegen schadelijke straling. Perifere mononucleaire bloedcellen (PB MNO's) kunnen worden verzameld in een uur van de bufferlaag na een eenvoudige gradiënt centrifugeren met behulp van Ficoll-Hypaque (1,077 g / ml). De verkregen PB MNO's zijn samengesteld uit lymfocyten, monocyten en een paar haemapoietische voorlopercellen (HPC) ^14. Hoewel humane T lymfocyten zijn een van de belangrijkste celtypen in PB, volwassen T cellen bevatten herrangschikkingen van het T-celreceptor (TCR) genen en ontberen een intact genoom teneinde hun voor toepassingen ^15,16 beperken. Evenwel verjonging van T-cellen via iPSC generatie potentiële toepassingen in chimère antigeen receptor (CAR) T-celtherapie ^17-19 hebben. In vergelijking, HPC's hebben een intact genoom en onmiddellijk herprogrammeerbaar. Hoewel slechts 0,01-0,1% cellen in de perifere circulatie zijn HPC's, kunnen deze cellen worden uitgebreid ex vivo in erythroïde medium dat proliferatie van erythr gunstenoid voorlopercellen ^14.

In onze eerdere studie, gebruikten we de factor BCL-XL naast de Yamanaka factoren (OCT4, SOX2, MYC en KLF4), wat resulteerde in een toename van 10x PB herprogrammering efficiëntie ^20. BCL-XL, ook bekend als BCL2L1, is een krachtige remmer van celdood, door het remmen activatie van caspases ^21,22. Maar kan BCL-XL ook een belangrijke rol spelen bij het handhaven pluripotentie ^21,22. Onlangs hebben we verder geoptimaliseerd EV herprogrammering systeem afzonderlijk tot expressie MYC en KLF4 met twee vectoren, die leidt tot een ongeveer 100x verhoging herprogrammering efficiëntie ^23. Met deze methode, de herprogrammering efficiency, gedefinieerd door kolonieaantal gedeeld door te beginnen celaantal bij transfectie is 0,2-0,5% van gezonde donoren. Als hieronder beschrijven we de gedetailleerde experimentele procedure voor het genereren integratie-vrij iPSCs van PB.