Summary

Generatie van Integratie-free geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke perifere mononucleaire bloedcellen behulp Episomaal Vectors

Published: January 01, 2017
doi:

Summary

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

Abstract

Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) houdt een grote belofte voor de ziekte van modellering en regeneratieve therapieën. We eerder gemeld het gebruik van Episomaal vectoren (EV) integratie-vrij iPSCs uit perifeer bloed mononucleaire cellen (MNC PB) te genereren. De episomale vectoren gebruikte DNA plasmiden samengebouwd met oriP en EBNA1 elementen van het Epstein-Barr (EB) -virus, die het mogelijk maken replicatie en langdurige retainment plasmiden in zoogdierlijke cellen. Met verdere optimalisatie kan duizenden iPSC kolonies worden verkregen bij 1 ml perifeer bloed. Twee kritische factoren voor het bereiken van hoge rendementen herprogrammering zijn: 1) het gebruik van een 2A "zelf-splitsing" peptide koppelen OCT4 en SOX2, hetgeen moet equimolaire expressie van de twee factoren; 2) het gebruik van twee vectoren om MYC en KLF4 afzonderlijk drukken. Hier beschrijven we een stap-voor-stap protocol voor het genereren van integratie-vrije iPSC's uit perifere bloedmonsters volwassene. De gegenereerde iPSCs zijn integratie-vrij als residuele episomale plasmiden zijn niet op te sporen na vijf passages. Hoewel de herprogrammering efficiëntie is vergelijkbaar met dat van Sendai virus (SV) vectoren, plasmiden EV aanzienlijk voordeliger dan de commercieel beschikbare vectoren SV. Deze betaalbare EV herprogrammering systeem houdt potentieel voor klinische toepassingen in de regeneratieve geneeskunde en biedt een aanpak voor de directe herprogrammering van PB multinationals om de integratie-vrije mesenchymale stamcellen, neurale stamcellen, enz.

Introduction

Na het gedwongen expressie van een aantal transcriptiefactoren (Dwz OCT4, SOX2, MYC en KLF4), kunnen somatische cellen worden geherprogrammeerd tot geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs), die een grote belofte voor toepassingen in regeneratieve geneeskunde en celvervangingstherapie 1-3 te houden. Tot op heden zijn verschillende werkwijzen ontwikkeld om het succes van herprogrammering 4-7 te verhogen. Virale vectoren geïnduceerde herprogrammering wordt veel gebruikt voor efficiënte generatie iPSC omdat virale integratie leidt tot een hoog niveau, stabiele expressie van de herprogrammering factoren. Echter kan permanente integratie van het vector DNA in het genoom insertie mutagenese 5 induceren. Bovendien kan onvoldoende inactivering van herprogrammering factoren iPSC differentiatie 8 verstoren. Als zodanig is het gebruik van iPSCs zonder integratie van herprogrammering factoren is noodzakelijk, met name voor toepassing bij celtherapie toepassingen.

<p class="jove_content"> Episomaal Vectors (EV) worden veel gebruikt bij het genereren van integratie-vrije iPSCs. De meest gebruikte EV is een plasmide dat twee elementen, oorsprong van virale replicatie (oriP) en EB Nuclear Antigen 1 (EBNA1), van het Epstein-Barr (EB) -virus 9. De oriP element bevordert plasmide replicatie in zoogdiercellen, terwijl de EBNA1 element aanbinden de oriP-bevattende plasmide-DNA aan het chromosomale DNA dat zorgt voor de verdeling van de episoom bij deling van de gastheercel. In vergelijking met andere integratie-vrij benaderingen, waaronder Sendai virus (SV) en RNA transfectie EV bezitten meerdere voordelen 5,6,10. Zoals plasmide-DNA, kunnen EV's gemakkelijk worden geproduceerd en gewijzigd in huis, waardoor ze zeer betaalbaar. Bovendien herprogrammering met EV is minder arbeidsintensief proces aangezien een enkele transfectie met EV volstaat iPSC productie, terwijl verschillende RNA transfecties nodig voor een succesvolle herprogrammering zijn.

DErmal fibroblasten werden gebruikt in vele studies herprogrammering. Echter, huidbiopsie is niet alleen een invasieve en pijnlijk proces, maar ook tijdrovend voor uitbreiding cellen voldoende hoeveelheden herprogrammering. Van groter belang zijn huidcellen van volwassen donoren vaak blootgesteld aan langdurige UV-straling, hetgeen kan leiden tot mutaties geassocieerd met tumoren, waardoor de verzoeken om iPSCs afgeleid van huidfibroblasten 11,12 beperken. Onlangs is vermeld dat normale menselijke huidcellen ophopen somatische mutaties en meerdere kankergenen, waaronder de meeste van de drijvende krachten cutane plaveiselcelcarcinomen, onder sterke positieve selectie 13.

In tegenstelling tot huidfibroblasten, perifeer bloed (PB) cellen een voorkeur bron van cellen voor herprogrammering omdat 1) bloedcellen gemakkelijk door een minimaal invasieve werkwijze kunnen worden verkregen, 2) perifere bloedcellen zijn het nageslacht van hematopoietische stamcellenwonende in het beenmerg, dus beschermd tegen schadelijke straling. Perifere mononucleaire bloedcellen (PB MNO's) kunnen worden verzameld in een uur van de bufferlaag na een eenvoudige gradiënt centrifugeren met behulp van Ficoll-Hypaque (1,077 g / ml). De verkregen PB MNO's zijn samengesteld uit lymfocyten, monocyten en een paar haemapoietische voorlopercellen (HPC) 14. Hoewel humane T lymfocyten zijn een van de belangrijkste celtypen in PB, volwassen T cellen bevatten herrangschikkingen van het T-celreceptor (TCR) genen en ontberen een intact genoom teneinde hun voor toepassingen 15,16 beperken. Evenwel verjonging van T-cellen via iPSC generatie potentiële toepassingen in chimère antigeen receptor (CAR) T-celtherapie 17-19 hebben. In vergelijking, HPC's hebben een intact genoom en onmiddellijk herprogrammeerbaar. Hoewel slechts 0,01-0,1% cellen in de perifere circulatie zijn HPC's, kunnen deze cellen worden uitgebreid ex vivo in erythroïde medium dat proliferatie van erythr gunstenoid voorlopercellen 14.

In onze eerdere studie, gebruikten we de factor BCL-XL naast de Yamanaka factoren (OCT4, SOX2, MYC en KLF4), wat resulteerde in een toename van 10x PB herprogrammering efficiëntie 20. BCL-XL, ook bekend als BCL2L1, is een krachtige remmer van celdood, door het remmen activatie van caspases 21,22. Maar kan BCL-XL ook een belangrijke rol spelen bij het handhaven pluripotentie 21,22. Onlangs hebben we verder geoptimaliseerd EV herprogrammering systeem afzonderlijk tot expressie MYC en KLF4 met twee vectoren, die leidt tot een ongeveer 100x verhoging herprogrammering efficiëntie 23. Met deze methode, de herprogrammering efficiency, gedefinieerd door kolonieaantal gedeeld door te beginnen celaantal bij transfectie is 0,2-0,5% van gezonde donoren. Als hieronder beschrijven we de gedetailleerde experimentele procedure voor het genereren integratie-vrij iPSCs van PB.

Protocol

Al het menselijk PB monsters werden verkregen uit anonieme volwassen donoren met geen identificatie-informatie beschikbaar van Tianjin Blood Center met toestemming van de lokale ethische toetsingscommissie. 1. Endo-free plasmidepreparaat Gebruik commerciële Plasmid Purification Kit Maxi tot episomale vectoren extract van E. coli volgens het protocol van de fabrikant. Voor de laatste stap, vervanging TE buffer endotoxine-vrij steriel water om de DNA pellet lossen. <l…

Representative Results

Met dit protocol, kunnen we honderden kolonies te verkrijgen van 1 x 10 5 nucleofected PB MDL (Figuren 1A en 1B). Herprogrammering efficiëntie bedraagt ongeveer 0,2-0,5% en de kolonies expressie pluripotentie markers (figuren 1C en 1D). iPSCs gegenereerd met de beschreven protocol zijn integratie-vrij en hebben de mogelijkheid om teratoma samenstellen van de 3 kiemlagen (Figuren 1E en <strong…

Discussion

Het verwerven van bloedmonsters van gezonde donoren en patiënten is handig en niet-invasieve, waardoor het een aantrekkelijk cel bron voor fundamenteel onderzoek en klinische celtherapie. Hier hebben we een protocol voor zeer efficiënte generatie van integratie-vrij iPSCs uit perifere bloedmonsters beschreven. Deze reproduceerbare en betaalbare benadering moet het veld iPSC profiteren.

We hebben gerapporteerd dat er twee kritische factoren die verantwoordelijk zijn voor de zeer efficiënte…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Ministry of Science and Technology of China (2015CB964902, 2013CB966902 and 2012CB966601), the National Natural Science Foundation of China (81500148, 81570164 and 81421002), the Loma Linda University School of Medicine GCAT grant (2015), and Telemedicine and Advanced Technology Research Center (W81XWH-08-1-0697).

Materials

Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium Sigma S0192 Store at 4 °C
Human stem cell factor (SCF) Peprotech 300-07 Store at -20 or -80°C
Interleukin-3 (IL-3) Peprotech AF-200-03 Store at -20 or -80°C
Eryrthropoietin (EPO) Peprotech 100-64 Store at -20 or -80°C
Insulin growth factor-1 (IGF-1) Peprotech 100-11 Store at -20 or -80°C
Dexamethasone Sigma D4902 Store at -20 or -80°C
1-thioglycerol (MTG) Sigma M6145 Store at -20 or -80°C
DMEM/F12 medium Gibco 112660-012 Store at 4 °C
L-glutamine (100x) Gibco 25030-081 Store at -20 °C
Penicillin/Streptomycin (100x) Gibco 15140-122 Store at -20 °C
Non-essential amino acids solution (100x) Gibco 11140-050 Store at 4 °C
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) Peprotech 100-18B Store at -20 or -80°C
ITS (100x) Gibco 41400-045 Store at 4 °C
Ascorbic acid Sigma 49752 Store at -20 °C
DMEM (high glucose) medium Thermo SH30243.01B Store at 4 °C
FBS Hyclone SV30087.01 Store at -40 °C
Ficoll GE Healthcare, SIGMA 17-5442-02 Store at RT
Trehalose  Sigma T9531 Store at 4 °C
DMSO Sigma D2650 Store at RT, protect from light
Endofree Plasmid Maxi Kit(10) Qiagen 12362 Store at RT
IMDM Gibco 21056-023 Store at 4 °C
Human CD34+ Cell Nucleofection Kit Lonza VPA-1003 Store at RT, nucleofection buffer and supplement buffer should be stored at 4 °C
Sodium butyrate Sigma B5887 Store at -20 or -80°C
ROCK inhibitor Y27632 STEMGENT 04-0012-10 Store at -20 °C
Essential 8 basal medium (E8) Gibco A15169-01 Store at 4 °C, the supplement should be stored at -20 or -80°C
Matrigel BD 354277 Store at -20 or -80°C
2x EasyTaq PCR SuperMix(+dye) TransGen Biotech AS111 Store at -20 °C
Cell detachment solution STEMGENT 01-0006 Store at -20 °C, Accutase as a cell detachment solution to obtain a single cell suspension
DAPI Sigma D9542-1MG Store at 4 °C or -20 °C
Anti-nanog-AF488 BD 560791 Store at 4 °C, primary antibody used for Immunofluorescence, dilute 1/100 when use
Anti-OCT4 abcam ab19857 Store at 4 °C, primary antibody used for Immunofluorescence, dilute 1/100 when use
AF488 donkey anti-mouse IgG Invitrogen A21202 Store at 4 °C, secondary antibody used for Immunofluorescence,  dilute 1/500 when use
PE anti-human TRA-1-60-R Antibody Biolegend 330610 Store at 4 °C, antibody used for flow cytometry
eFluor 570-conjugated anti-SSEA4 eBioscience 41-8843 Store at 4 °C, antibody used for flow cytometry
Isotype antibody eBioscience 11-4011 Store at 4 °C, antibody used for flow cytometry
Alkaline Phosphatase Detection Kit SiDanSai 1102-100 Store at 4 °C
Genomic DNA Extraction Kit TIANGEN DP304-02 Store at RT
Trypan Blue solution Sigma T8154 Store at RT
Flow cytometry cell analyzer BD LSRII for flow cytometry analysis
Spinning disk confocal microscope (SDC) PerkinElmer UltraVIEW VOX for confocal imaging
Nucleofection device Lonza Nucleofector 2b for the nucleofection of PB MNC
ImageQuant LAS-4010 GE take photo of AP staining in bulk

References

  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  3. Trounson, A., McDonald, C. Stem Cell Therapies in Clinical Trials: Progress and Challenges. Cell Stem Cell. 17, 11-22 (2015).
  4. Hayes, M., Zavazava, N. Strategies to generate induced pluripotent stem cells. Methods Mol Biol. 1029, 77-92 (2013).
  5. Zhang, X. B. Cellular reprogramming of human peripheral blood cells. Genomics Proteomics Bioinformatics. 11, 264-274 (2013).
  6. Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nat Biotechnol. 33, 58-63 (2015).
  7. Okita, K., et al. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 31, 458-466 (2013).
  8. Carey, B. W., et al. Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 9, 588-598 (2011).
  9. Dorigo, O., et al. Development of a novel helper-dependent adenovirus-Epstein-Barr virus hybrid system for the stable transformation of mammalian cells. J Virol. 78, 6556-6566 (2004).
  10. Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nat Protoc. 7, 2013-2021 (2012).
  11. Harms, P. W., et al. Next generation sequencing of Cytokeratin 20-negative Merkel cell carcinoma reveals ultraviolet-signature mutations and recurrent TP53 and RB1 inactivation. Mod Pathol. 29, 240-248 (2016).
  12. Abyzov, A., et al. Somatic copy number mosaicism in human skin revealed by induced pluripotent stem cells. Nature. 492, 438-442 (2012).
  13. Martincorena, I., et al. Tumor evolution. High burden and pervasive positive selection of somatic mutations in normal human skin. Science. 348, 880-886 (2015).
  14. Su, R. J., Neises, A., Zhang, X. B. Generation of iPS Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors. Methods Mol Biol. 1357, 57-69 (2016).
  15. Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).
  16. Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).
  17. Kishino, Y., Seki, T., Yuasa, S., Fujita, J., Fukuda, K. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions. J Vis Exp. , (2015).
  18. Seki, T., Yuasa, S., Fukuda, K. Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus. Nat Protoc. 7, 718-728 (2012).
  19. Gill, S., June, C. H. Going viral: chimeric antigen receptor T-cell therapy for hematological malignancies. Immunological reviews. 263, 68-89 (2015).
  20. Su, R. J., et al. Efficient generation of integration-free ips cells from human adult peripheral blood using BCL-XL together with Yamanaka factors. PLoS One. 8, e64496 (2013).
  21. Li, Y., et al. The p53-PUMA axis suppresses iPSC generation. Nat Commun. 4, 2174 (2013).
  22. Hardwick, J. M., Youle, R. J. SnapShot: BCL-2 proteins. Cell. 138, 404 (2009).
  23. Wen, W., et al. Enhanced Generation of Integration-free iPSCs from Human Adult Peripheral Blood Mononuclear Cells with an Optimal Combination of Episomal Vectors. Stem Cell Reports. 6, 873-884 (2016).
  24. Zhang, X. B., et al. Trehalose ameliorates the cryopreservation of cord blood in a preclinical system and increases the recovery of CFUs, long-term culture-initiating cells, and nonobese diabetic-SCID repopulating cells. Transfusion. 43, 265-272 (2003).
  25. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
  26. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. , (2010).
  27. Castiel, A., et al. Cell death associated with abnormal mitosis observed by confocal imaging in live cancer cells. J Vis Exp. , e50568 (2013).
  28. Peterson, S. E., et al. Teratoma generation in the testis capsule. J Vis Exp. , e3177 (2011).
  29. Ritner, C., Bernstein, H. S. Fate mapping of human embryonic stem cells by teratoma formation. J Vis Exp. , (2010).
  30. Wen, W., et al. Enhanced Generation of Integration-free iPSCs from Human Adult Peripheral Blood Mononuclear Cells with an Optimal Combination of Episomal Vectors. Stem Cell Reports. , (2016).
  31. Lo, C. A., et al. Quantification of Protein Levels in Single Living Cells. Cell Rep. 13, 2634-2644 (2015).
  32. Liu, S. P., et al. An improved method for generating integration-free human induced pluripotent stem cells. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. 22, 580-587 (2014).
  33. Luni, C., et al. High-efficiency cellular reprogramming with microfluidics. Nat Methods. 13, 446-452 (2016).
  34. Chou, B. K., et al. A facile method to establish human induced pluripotent stem cells from adult blood cells under feeder-free and xeno-free culture conditions: a clinically compliant approach. Stem Cells Transl Med. 4, 320-332 (2015).
  35. Nakagawa, M., et al. A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells. Sci Rep. 4, 3594 (2014).
  36. Howden, S. E., et al. Simultaneous Reprogramming and Gene Correction of Patient Fibroblasts. Stem Cell Reports. 5, 1109-1118 (2015).
  37. Meng, X., et al. Rapid and efficient reprogramming of human fetal and adult blood CD34+ cells into mesenchymal stem cells with a single factor. Cell research. 23, 658-672 (2013).
  38. Liao, W., et al. Direct Conversion of Cord Blood CD34+ Cells Into Neural Stem Cells by OCT4. Stem cells translational medicine. 4, 755-763 (2015).

Play Video

Citer Cet Article
Wen, W., Zhang, J., Chen, W., Arakaki, C., Li, X., Baylink, D., Botimer, G. D., Xu, J., Yuan, W., Cheng, T., Zhang, X. Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors. J. Vis. Exp. (119), e55091, doi:10.3791/55091 (2017).

View Video