FIM è un nuovo sistema, il costo di imaging efficace progettato per monitorare piccoli oggetti in movimento, quali C. elegans, planaria o Drosophila larve. Il programma FIMTrack di accompagnamento è stato progettato per fornire analisi dei dati veloce ed efficiente. Insieme, questi strumenti permettono analisi high-throughput di tratti comportamentali.
L'analisi della funzione di rete neuronale richiede una misura affidabile di tratti comportamentali. Poiché il comportamento degli animali liberi di muoversi è variabile in una certa misura, molti animali devono essere analizzati per ottenere dati statisticamente significativi. Questo a sua volta richiede un computer assistita quantificazione automatizzata di modelli locomozione. Per ottenere immagini ad alto contrasto di oggetti in movimento quasi traslucidi e piccoli, è stata sviluppata una tecnica di imaging romanzo basato sulla riflessione interna totale chiamato FIM. In questa configurazione, gli animali sono illuminate solo con luce infrarossa nella posizione molto specifico di contatto con la superficie sottostante scansione. Questa metodologia si traduce in immagini molto alto contrasto. Successivamente, queste immagini ad alto contrasto vengono elaborate utilizzando algoritmi di monitoraggio contorno stabiliti. Sulla base di questo, abbiamo sviluppato il software FIMTrack, che serve ad estrarre un numero di caratteristiche necessarie per descrivere quantitativamente una grande varietà di locomozioneCaratteristiche. Durante lo sviluppo di questo pacchetto software, abbiamo concentrato i nostri sforzi su un'architettura open source che permette la facile aggiunta di ulteriori moduli. Il programma funziona piattaforma indipendente ed è accompagnata da un interfaccia grafica intuitiva che guida l'utente attraverso l'analisi dei dati. Tutti i valori di parametro locomozione sono espressi in forma di file CSV, per permettere ulteriori analisi dei dati. Inoltre, un visualizzatore Risultati integrato nel software di monitoraggio fornisce l'opportunità di rivedere in modo interattivo e regolare l'uscita, come potrebbe essere necessario durante l'integrazione di stimolo. Il potere di FIM e FIMTrack è dimostrato studiando la locomozione di Drosophila larve.
Maggior parte degli animali hanno la capacità di muoversi in modo altamente sofisticato e controllato. Per decifrare la base sottostante di controllo locomozione genetico è obbligatorio valutare quantitativamente modelli comportamentali diversi. A questo proposito, Drosophila può servire come un modello ideale. Monitoraggio di volare liberamente Drosophila è allettante 1-4 ma strisciare di Drosophila larve avviene in due dimensioni a velocità relativamente bassa e può quindi essere controllato facilmente. Setup basato su telecamera in combinazione con un'illuminazione adeguata vengono utilizzati per acquisire immagini 5. Entrambi incidente o la luce trasmessa è impiegato in esperimenti comportamentali 6,7. Tuttavia, a causa del corpo semi-trasparente delle larve e possibili riflessi di luce della superficie di scansione registrazione fedele dei movimenti larvali può essere difficile. Per superare tali problemi, sono stati ideati alcuni metodi complessi. Recentemente, illuminazione campo scuro è stato introdotto per migliorare in primo piano / sfondo contRAST 8. In alternativa alla registrazione basato su telecamera, imaging ottico lente-meno e image-sensore-less on-chip sono state introdotte tecniche di acquisizione 9-11.
Sono stati introdotti di recente diversi programmi di monitoraggio, includendo in commercio software 12 e personalizzate soluzioni. Esempi di programmi di monitoraggio ad elevato throughput sono il Worm Tracker Multi (MWT) 13 e Multianimal deambulazione e Track (Magat) 8. Entrambi hanno in comune, che più gli animali possono essere monitorati in un unico un'arena aperta campo in modo che gli animali in collisione portano a molteplici nuove identità degli animali. Per superare questo limite, una configurazione multi-pozzo è stata introdotta la separazione 12 animali in singoli pozzetti 14. Quantificazione precisa di locomozione di singoli individui può essere ottenuto utilizzando una fase mobile di inseguimento in combinazione con un microscopio 15. Tuttavia, tutti questi approcci sono o costo inefficienti, mancanza sufficienti resoluzione o troppo tempo per alta fenotipizzazione produttività.
Per superare le limitazioni di cui sopra, abbiamo sviluppato FIM (Metodo Imaging basato FTIR) basato su Frustrated Total Internal Reflection (FTIR) 16 (Figura 1). Questo nuovo approccio di imaging offre un elevato contrasto senza precedenti e permette anche la registrazione multi-colore di strisciare animali 16. Il principio alla base di questo metodo pratico ed efficace è facile. Un piatto di vetro acrilico è inondato di luce (ad esempio, 875 nm infrarosso). A causa dei diversi indici di rifrazione di vetro acrilico e aria, la luce viene riflessa totalmente al confine vetro / aria. Nessun riscaldamento del vetro acrilico è notato 16. Solo se gli oggetti con un indice di rifrazione più alto toccare il tavolo luminoso, può illuminare entrare in questi oggetti. Se gli animali toccano la superficie, luce viene riflessa e può essere catturato dal basso (Figura 1). Di conseguenza, solo il contattozona degli animali appare come un punto luminoso, che permette l'imaging dettagliato con uno sfondo nero globale. Così, FIM imaging consente di registrare filmati perfetti per gli algoritmi di visione artificiale. L'utilizzo semplice e robusto di FIM ora porta dettagliata analisi high throughput del comportamento animale complesso in mano e può essere utilizzato per studiare le informazioni di trasformazione: ad esempio, l'olfatto 8, 16; visione 17 o thermosensation 18.
Figura 1. configurazione FIM con integrazione di calore-stimolo e principi fisici sottostanti. (A) L'impostazione FIM. Intensità di illuminazione può essere regolata dal pannello frontale. (B) Per fornire uno stimolo termico, una piastra di alluminio verniciato nero, perfusi con acqua calda e fredda su entrambi i lati, è disposto 2 mm dalla superficie di agar chesé è spessore 2 mm. Il gradiente è stabilito sulla piastra radiatore di calore e l'agar dalle differenze di temperatura (C) Il principio fisico della riflessione interna totale. Una lastra di vetro acrilico viene illuminato da luce infrarossa. θ 1, θ 2, θ e 3 indicano gli angoli di riflessione della luce. n A, n 1, n 2 e n 3 indicano gli indici di rifrazione dell'aria, vetro acrilico, agar e la larva rispettivamente e compiere la disuguaglianza n A <n 1 <n 2 <n 3. A causa rifrazione, l'angolo di riflessione cambia durante la transizione. Se l'angolo è sotto l'angolo critico, la luce non si riflette più, può passare attraverso gli strati e può essere catturato da sotto. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
La spectrum di processi che possono essere analizzati da FIM è ampio. Senza ulteriori aggiustamenti, immagini FIM può essere utilizzato per monitorare tutte le fasi larvali di Drosophila (Figura 5B) o può essere usato per seguire le impronte di piede-adulto Drosophila 19. Analogamente, le traiettorie di C. elegans o il movimento di vermi piatti planaria può essere facilmente registrati (Figura 5C). Anche l'analisi della crescita ifa o radice dei capelli fungina appare fattibile 19. Nella nostra attuale configurazione FIM, 4 x 16 diodi emettitori di luce infrarossa (IR LED) sono integrati in un cm 2 lastra di vetro acrilico 32 x 32, chiamata tabella di rilevamento (Figura 1). L'intensità del IR-LED viene regolata in funzione del peso degli oggetti sulla tabella di rilevamento, che può essere fatto facilmente da un microcontrollore collegato al circuito tramite modulazione di larghezza di impulso (PWM). FIM produce immagini molto alto contrasto su una vasta gamma di intensità di illuminazione. Importante, gennomiche ottimi risultati a già basso irridation infrarossi generale.
Una fotocamera con un filtro a infrarossi è posto sotto la tabella di monitoraggio, che consente l'integrazione di altri stimoli nel setup. Stimoli di calore possono essere facilmente applicati da una piastra radiatore di calore e stimoli luminosi sono applicati da un proiettore LCD. Anche odoranti possono essere contenuti in gradienti da coperchi semplici 8. Per gli esperimenti gradiente di calore, la piastra radiatore di calore è perfuso con acqua calda e fredda su entrambi i lati rispettivamente e disposto 2 mm dal larve (Figura 1B).
La generazione di alto contrasto, filmati di alta qualità apre la possibilità per sofisticate analisi delle immagini computer basato, quindi abbiamo implementato il software FIMTrack per estrarre un grande insieme di caratteristiche da immagini (Figura 2). Primi sei caratteristiche principali sono definite dal contorno dell'animale (Figura 3A). Queste caratteristiche forniscono la linea di baseper ulteriori calcoli di sei caratteristiche secondarie che descrivono la forma animali e la sua posizione in determinati stimoli in un dato punto di tempo (Figura 3B). Attualmente, nove funzioni terziarie sono calcolati che sono integrando aspetti temporali e quindi caratterizzano la locomozione dell'animale insieme con le caratteristiche primarie e secondarie (Figura 3C).
Figura 2. Panoramica FIMTrack, il flusso di lavoro e la rappresentazione algoritmica larvale. (A) Come utilizzare FIMTrack. Le immagini vengono caricate. Grigio soglia di valore e limiti numerici larvali definiscono solo le larve devono essere impostati. L'area larvale deve essere in [min-size, max-size]. Monitoraggio viene avviato dal pulsante evidenziato. Workflow (B) di inseguimento. Dopo il pulsante di avvio si fa clic, l'immagine di sfondo è calculated (intensità minima nel tempo). Finché ci sono fotogrammi di sinistra, le larve sono segmentati in base alla soglia grigio e il MIN e soglia di max-size. Per tutte le segmentazioni le rappresentazioni larvali sono calcolati (confrontare (C)). Ogni nuovo modello è associato ad una determinata traiettoria se una traccia valido è disponibile. Se si raggiunge l'ultimo fotogramma, finalizzando la post-elaborazione viene eseguita seguita dalla generazione di uscita. (C) rappresentazione larvale. L'animale è costituito da una testa e un punto di coda (h e t). Tra questi punti un arbitrario numero dispari di punti della colonna vertebrale s i può essere impostato con un raggio r i. Inoltre, il centro di massa m ed il corpo principale piegatura γ angolari sono calcolati. Diversi parametri di movimento correlati sono delineati da linee viola. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
In neuroscienze comportamentali è obbligatorio decifrare quantitativamente tratti comportamentali complessi. Sono necessari dunque, un gran numero di persone devono essere osservate ad alta risoluzione e automatizzate le procedure per l'analisi statistica. Qui, l'imaging FIM è descritto, un romanzo, l'installazione di immagini semplice e robusto, che fornisce i mezzi per monitorare locomozione di una vasta gamma di animali. L'efficacia del setup di imaging FIM è stata testata utilizzando Drosophila larve, vermi piatti planaria e C. vermi elegans. La tecnologia FIM fornisce intrinsecamente alto contrasto per rilevare anche strutture interne degli animali, come il cervello, trachea, l'intestino o proventricolo. È importante sottolineare che queste strutture interne robusto sono identificati in modo che possano servire per identificare automaticamente l'orientamento dell'animale 19.
La qualità dei film può essere influenzata dalla quantità eccessiva di acqua sulla superficie di scansione. Pertanto, è fondamentalecontrollare l'umidità del agar. Troppo vecchio acqua agar o troppo sulla superficie può causare artefatti. Allo stesso modo, assicurarsi che non bolle d'aria sono compresi nella superficie scansione. In generale, una superficie agar ben preparato consente la registrazione di filmati per 4 ore.
A causa dei principi fisici alla base di imaging FIM genera quasi rumore registrazioni di immagini gratuito, con un conseguente qualità di immagine eccellente. Ciò consente la successiva analisi di immagini computer-based e consente un elevato throughput. Tuttavia, la metodologia è limitato all'analisi di animali che contattano direttamente la superficie agar. Il software di monitoraggio è sfidato da animali che forma una forma di ciambella. Anche se un indicatore binario riconosce la forma di ciambella, una spina errato potrebbe essere calcolato.
Grazie alla costruzione modulare del tavolo di monitoraggio dual e triple immagini a colori è a portata di mano. Inoltre, altri stimoli (luce, odori, stimoli elettrici o meccanici) possono facilmente essere delivered dall'alto. Il programma FIMTrack progettato per abbinare il potere delle immagini FIM può essere facilmente adottato per monitorare Drosophila larve, C. elegans o planarie. Così e grazie alla sua costruzione semplice ed economico (vedi http://FIM.uni-muenster.de), l'imaging FIM è fattibile per una vasta gamma di applicazioni biomediche e in particolare consente di urgenza studi elevati di throughput.
The authors have nothing to disclose.
Siamo grati a S. Tommaso, che ha avviato questo progetto, J. Hermann e U. Burgbacher aiuto nella costruzione del setup FIM. Questo lavoro è stato finanziato dalla DFG (SFB 629 B6).
Name of the Material/Equipment | Source | Catalog Number | Comments |
FIM setup | Custom | details for construction or purchase of setups is available upon request | |
Acrylic glass plate | Custom | Additional for agar pouring | |
Heat radiator plate | Custom | Aluminum plate (paintet in matt black) perfusable on opposing sites with adjustable mounting | |
Water calorifier/cooling pumps and hoses | Custom | based on GE healthcare MultiTempIII (No.: 18-1102-78) and Dr Bruno Lange GmBH (Typ: LTG013) | |
Standard Camera (4 MP) | Basler | acA2040-25gm | Camera defaultly used for the FIM setup |
Test Camera (1.4 MP) | QImaging | 1394 firewire (01- QIC-F-M-12 MONO) | Camera used for comparison |
Test Camera (0.8 MP) | Point Grey | Dragonfly 2 (DR2-13S2M/C-CS) | Camera used for comparison |
Test Camera (0.3 MP) | Sony | PS Eye USB2.0 camera | Camera used for comparison |
Computer | Custom | equipped with at least i5 Intel processor or better, 16 GB RAM and sufficient HDD storage space [>1TB] | |
Standard Fly food | Custom | ||
Standard Fly vials 135 ml | Sarstedt AG&Co, Nümbrecht, Germany | 78,895 | |
Petri dishes 9cm | Sarstedt AG&Co, Nümbrecht, Germany | 821,473 | |
Ultrapure deionized water | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | Synergy | |
NaCl | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 3957.2 | |
Food grade agar | AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany | A0917,5000 | |
Paintbrush (small and large) | Milan | Aquarell 310 Size 0 and 2 | |
Pyrometer | Trotec | BP20 |