FIM C gibi küçük hareketli nesneleri izlemek için tasarlanmış bir roman, maliyet etkin bir görüntüleme sistemi elegans, planaria veya Drosophila larvaları. Ekteki FIMTrack programı hızlı ve verimli veri analizi sunmak için tasarlanmıştır. Birlikte, bu araçlar davranışsal özelliklerin yüksek verim analizi sağlar.
nöronal ağ fonksiyonu analizi davranışsal özelliklerinin güvenilir bir ölçüm gerektirir. Serbest hareket eden hayvanlar arasında, belirli bir zaman bir dereceye kadar değişken olduğu için, pek çok hayvan istatistiksel olarak anlamlı veriler elde etmek için, analiz edilmesi gerekir. Bu da hareket desenleri bir bilgisayar destekli otomatik ölçümü gerektirir. Neredeyse saydam ve küçük hareketli nesnelerin yüksek kontrastlı görüntüler elde etmek için, FIM denilen sinirli toplam iç yansıma dayalı yeni bir görüntüleme tekniği geliştirilmiştir. Bu ayarda, hayvanlar sadece altta yatan tarama yüzeyi ile temas çok özel konumda kızılötesi ışık ile aydınlatılmış. Bu metodoloji çok yüksek kontrastlı görüntüler elde edilir. Daha sonra, bu yüksek kontrastlı görüntüler kurulan kontur izleme algoritmaları kullanılarak işlenir. Buna göre, kantitatif hareket yeteneği büyük bir çeşitlilik tanımlamak için gerekli olan bir dizi özellik elde etmek için karşılık vermektedir FIMTrack yazılımı geliştirmiştirözellikleri. Bu yazılım paketinin geliştirilmesi sırasında, biz daha fazla modüllerin kolay eklenmesini sağlayan bir açık kaynak mimarlık bizim çabaları yoğunlaşmıştır. Program platform bağımsız çalışır ve veri analizi ile kullanıcıya rehberlik sezgisel bir kullanıcı arayüzü eşlik ediyor. Tüm hareket parametre değerlerinin daha fazla veri analizleri izin csv dosyaları şeklinde verilmiştir. Buna ek olarak, izleme yazılımına entegre bir Sonuçları Görüntüleyici etkileşimli gözden ve uyarıcı entegrasyonu sırasında gerekebilecek gibi, çıkışını ayarlamak için fırsat sağlar. FIM ve FIMTrack gücü Drosophila larvalarının lokomosyon inceleyerek gösterilmiştir.
Çoğu hayvanlar son derece sofistike ve kontrollü bir şekilde hareket yeteneğine sahip. Genetik temeli altta yatan hareket kontrolünden deşifre kantitatif farklı davranış kalıpları değerlendirmek zorunludur. Bu bağlamda, Drosophila ideal bir model olarak hizmet edebilir. Özgürce uçan Drosophila Takip vermeyen 1-4 ama oluşur nispeten düşük hızda iki boyutta Drosophila larva tarama ve böylece kolayca izlenebilir edilir. Uygun aydınlatma ile birlikte kamera tabanlı kurulumları görüntüleri 5 elde etmek için kullanılır. Olay veya iletilen ışık ikisi de davranışsal deneyler 6,7 istihdam edilmektedir. Ancak, larva ve larva hareketlerin tarama yüzeyi sadık kayıt olası ışık yansımaları yarı-saydam vücut için zor olabilir. Bu tür sorunların üstesinden gelmek için bazı karmaşık yöntemler geliştirilmiştir. Son zamanlarda, karanlık alan aydınlatma ön / arka cont geliştirmek tanıtıldırast 8. Kamera tabanlı kayıt, lens daha az optik görüntüleme ve alternatif olarak görüntü sensörü-az on-chip satın alma teknikleri 9-11 tanıtıldı.
Çeşitli izleme programları piyasada mevcut yazılım 12 ve özel çözümler de dahil olmak üzere, son zamanlarda getirilmiştir. Yüksek verimli izleme programları için örnekler Çok Worm Tracker (MWT) olan 13 ve Multianimal Yürüme Ve Parça (MAGAT) 8. Çarpışan hayvanlar çok sayıda yeni hayvan kimlikleri yol böylece ikisi de ortak, birden fazla hayvan, tek bir açık alan arenada izlenebilir var. Bu sınırlamayı aşmak için, bir çok iyi Kur bireysel kuyuların 14 içine 12 hayvan ayıran tanıtıldı. Tek tek bireylerin lokomosyon kesin miktar mikroskop 15 ile birlikte hareketli bir izleme aşaması kullanılarak elde edilebilir. Ancak, tüm bu yaklaşımlar, ya maliyet verimsiz, eksikliği yeterli yenidençözüm veya yüksek verimli fenotipleme için alıcı çok zaman.
Sinirli Toplam İç Yansıma (FTIR) 16 (Şekil 1) dayalı, yukarıda belirtilen sınırlamaları aşmak için, biz geliştirdik FIM (FTIR-tabanlı Görüntüleme Yöntemi). Bu yeni görüntüleme yaklaşımı benzeri görülmemiş bir yüksek kontrast sağlar ve hatta hayvanların 16 emekleme çok renkli kaydedilmesini sağlar. Bu kullanışlı ve etkili bir yöntem yatan prensibi kolaydır. Akrilik cam plaka ışığı ile sular altında (örneğin, 875 kızılötesi nm). Nedeniyle akrilik cam ve hava farklı kırılma endekslerine göre, ışık tamamen cam / hava sınırında yansıtılır. Akrilik cam Isıtma yok 16 olduğunu kaydetti. Daha yüksek bir kırılma indeksine sahip nesneler aydınlık bir tablo dokunmayın Sadece eğer, bu nesneleri girebilirsiniz ışık olabilir. Hayvanlar yüzeye dokunursanız, ışık yansır ve (Şekil 1) aşağıdan yakalanabilir. Sonuç olarak, sadece kontakHayvanların alan genel bir siyah arka plan ile ayrıntılı görüntüleme sağlayan bir parlak nokta olarak görünür. Böylece, FIM-görüntüleme, bilgisayar görme algoritmaları için mükemmel filmler kaydetmenize olanak verir. FIM basit ve sağlam kullanımı artık erişemeyeceği içine karmaşık hayvan davranışları ayrıntılı yüksek kapasiteli analizini getiriyor ve işleme bilgisini çalışmak için kullanılabilir: örneğin, koku alma duyusunu 8, 16; vizyon 17 veya thermosensation 18.
Isı-uyaran entegrasyonu ve altta yatan fiziksel ilkeler 1. FIM kurulum Şekil. (A) FIM kurulum. Aydınlatma yoğunluğu ön panelde kontrol edilebilir. (B), bir ısı uyaran sunmak için, siyah, alüminyum levha boyalı her iki yanında sıcak ve soğuk su ile perfüze agar yüzeyi üzerinde 2 mm yerleştirildiğikendisi 2 mm kalınlığındadır. gradyan sıcaklık farkları ile radyatör plaka ve agar üzerine kurulmuştur (C) sinirli toplam iç yansıma fiziksel prensibi:. Bir akrilik cam plaka kızılötesi ışık ile aydınlatılıyor. θ 1, θ 2, θ ve 3 ışık yansıması açıları göstermektedir. n, A, 1, n = 2 ve n = 3 n, sırasıyla hava, akrilik cam, agar ve larva kırılma indislerine gösterir ve eşitsizliği n A <n, 1 <n, 2 <n, 3 yerine getirmektedir. Nedeniyle kırılma için, yansıma açısı geçişi sırasında değişir. Açı kritik açı altında ise, ışık artık yansıtılmamıştır katmanları geçebilir ve aşağıdan yakalanabilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
spFIM ile analiz edilebilir işlemlerin ectrum geniştir. Başka ayarlamalar olmadan FIM görüntüleme Drosophila (Şekil 5B) tüm larva evreleri izlemek için kullanılabilir veya Drosophila 19 yetişkin taban izlerine takip etmek için kullanılabilir. C. Aynı şekilde, yörüngeleri elegans veya planarian flatworms hareketi kolayca (Şekil 5C) kaydedilebilir. Mantar hif veya kök saç büyüme bile analizi mümkün 19 belirir. Mevcut FIM kurulumunda, 4 x 16 kızılötesi ışık yayan diyotlar (LED'ler IR) (Şekil 1) izleme tablosu olarak adlandırılan, 32 x 32 cm 2 akrilik cam plaka içine entegre edilmiştir. IR LED yoğunluğu kolaylıkla darbe genişlik modülasyonu (PWM) ile devresine bağlı bir mikro kontrol cihazı tarafından yapılabilir izleme masanın üzerine yerleştirilmiş, ağırlığına bağlı olarak ayarlanır. FIM aydınlatma şiddetleri geniş bir yelpazede üzerinde çok yüksek kontrastlı görüntüler verir. Önemlisi, bu genzaten düşük toplam kızılötesi irridation mükemmel sonuçlar, kalkış sırasında.
Kızılötesi filtre ile bir kamera kurulum içine ek uyaranların entegrasyonunu sağlayan izleme masası, aşağıda yer almaktadır. Isı uyarıcı kolayca radyatör plakası ile uygulanabilir ve hafif uyaran bir LCD projektör tarafından uygulanır. Ayrıca odorants basit kapak 8 ile geçişlerini bulunan edilebilir. Isı gradyanı deneyleri için, radyatör plaka, sırasıyla her iki tarafında, sıcak ve soğuk su ile perfüze edildi ve larvaları (Şekil 1B) 2 mm yukarısında, yerleştirilir.
yüksek kontrast, yüksek kaliteli filmleri nesil gelişmiş bilgisayar tabanlı görüntü analizi için olasılığını açar, böylece biz görüntülerden özellikleri büyük bir set ayıklamak için (Şekil 2) FIMTrack yazılımını uyguladı. İlk altı temel özellikleri hayvanın (Şekil 3A) ve konturdan tanımlanmıştır. Bu özellikler temel sağlarBelirli bir zaman noktasında (Şekil 3B) de hayvanlar şekil ve bazı uyaranlar onun konumunu tanımlayan altı ikincil özellikleri daha hesaplanması için. Şu anda, dokuz üçüncül özellikleri zamansal yönlerini entegre ve dolayısıyla birincil ve ikincil özellikleri (Şekil 3C) ile birlikte hayvan lokomosyon karakterize olduğu hesaplanmaktadır.
Şekil 2. FIMTrack genel bakış, algoritmik iş akışı ve larva gösterimi. (A) Nasıl FIMTrack kullanmak için. görüntüleri yüklenir. Gri değer eşik ve tek larvaları tanımlayan larva boyut eşikleri ayarlanması gerekir. larva alan [min-boyutu, maksimum boyut] olmalıdır. Takip Vurgulanan düğme ile başlatılır. (B) İzleme iş akışı. Start düğmesine tıkladıktan sonra, arka plan görüntüsü cayeniden hesaplanır (zaman içinde en az yoğunlukları). Sürece sol kare olduğu gibi, larva gri eşik ve min- ve maksimum boyutu eşiğine göre segmentlere ayrılmıştır. Larva temsiller hesaplanır tüm segmentlerinin için ((C) karşılaştırmak). Her yeni model geçerli parça mevcut ise, belirli bir yörünge için ilişkilidir. Son kare ulaşılırsa, sonuçlandırılması sonrası işleme çıkış kuşak tarafından takip yapilir. (C) Larva temsil. Hayvan bir baş ve kuyruk noktası (h t) oluşur. Bu noktalar arasında omurga noktaları s keyfi bir tek sayı i r yarıçaplı i ayarlanabilir. Ayrıca, kütle m ve açı γ bükme ana gövdenin merkez hesaplanır. Birkaç hareket ile ilgili parametreler mor çizgilerle çizilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Davranışsal nörobilim kantitatif karmaşık davranışsal özellikleri deşifre zorunludur. Bu nedenle, çok sayıda insanın, yüksek çözünürlükte görülen ve otomatik gereken işlemler istatistiksel analiz için ihtiyaç vardır. Burada, FIM görüntüleme, hayvanların geniş bir hareketlilik izlemek için araçlar temin eden bir yeni, basit ve sağlam bir görüntü kurulumu tarif edilmektedir. FIM görüntüleme kurulum etkinliği Drosophila larvaları, planarian flatworms ve C kullanılarak test edilmiştir elegans solucanlar. FIM teknoloji, beyin, trakea, bağırsak veya proventriculus gibi hayvanların bile iç yapılarını tespit etmek özünde yüksek kontrast sağlar. Otomatik hayvan 19 yönünü belirlemek için hizmet edebilir, böylece önemlisi, bu iç yapılar sağlam tanımlanır.
filmlerin kalitesi tarama yüzeyi üzerinde suyun aşırı miktarı ile etkilenebilir. Bu nedenle, çok önemlidiragar nem kontrolü. Yüzeyde Çok eski agar veya çok fazla su eserler neden olabilir. Benzer şekilde, herhangi bir hava kabarcığı tarama yüzey dahil olduğundan emin olun. Genel olarak, iyi hazırlanmış agar yüzeyi 4 saat film kaydı sağlar.
Nedeniyle yatan fiziksel ilkelere FIM görüntüleme mükemmel bir görüntü kalitesi elde, neredeyse gürültü ücretsiz resim kayıtları üretir. Bu da, daha sonra, bilgisayar tabanlı imaj analizi kolaylaştırır ve yüksek verim sağlar. Ancak, bu yöntemin doğrudan agar yüzeyine temas hayvanları analiz sınırlıdır. izleme yazılımı çörek şekli oluşturan hayvanlar tarafından meydan. Ikili gösterge çörek şekli tanır rağmen, yanlış omurga hesaplanır olabilir.
Nedeniyle izleme tablosu ikili ve üçlü renk görüntüleme modüler inşaat ulaşmak olduğunu. Ayrıca, ek uyaranlar (ışık, koku verme maddeleri, elektrik veya mekanik uyarıcılar) kolayca olabilir delYukarıda ivered. FIM görüntüleme gücünü maç için tasarlanmış FIMTrack programı kolayca Drosophila larvaları, C izlemek için kabul edilebilir elegans veya planarya. Böylece nedeniyle onun basit ve ucuz inşaat (http://FIM.uni-muenster.de bakınız), FIM görüntüleme biyomedikal uygulamalarda geniş bir yelpazede için uygun olan ve özellikle acilen yüksek verimli çalışmaları gereklidir sağlar.
The authors have nothing to disclose.
Biz FIM kurulum yapımında yardım için bu projeyi başlattı S. Thomas J. Hermann ve U. Burgbacher müteşekkiriz. Bu çalışma DFG (SFB 629 B6) tarafından finanse edildi.
Name of the Material/Equipment | Source | Catalog Number | Comments |
FIM setup | Custom | details for construction or purchase of setups is available upon request | |
Acrylic glass plate | Custom | Additional for agar pouring | |
Heat radiator plate | Custom | Aluminum plate (paintet in matt black) perfusable on opposing sites with adjustable mounting | |
Water calorifier/cooling pumps and hoses | Custom | based on GE healthcare MultiTempIII (No.: 18-1102-78) and Dr Bruno Lange GmBH (Typ: LTG013) | |
Standard Camera (4 MP) | Basler | acA2040-25gm | Camera defaultly used for the FIM setup |
Test Camera (1.4 MP) | QImaging | 1394 firewire (01- QIC-F-M-12 MONO) | Camera used for comparison |
Test Camera (0.8 MP) | Point Grey | Dragonfly 2 (DR2-13S2M/C-CS) | Camera used for comparison |
Test Camera (0.3 MP) | Sony | PS Eye USB2.0 camera | Camera used for comparison |
Computer | Custom | equipped with at least i5 Intel processor or better, 16 GB RAM and sufficient HDD storage space [>1TB] | |
Standard Fly food | Custom | ||
Standard Fly vials 135 ml | Sarstedt AG&Co, Nümbrecht, Germany | 78,895 | |
Petri dishes 9cm | Sarstedt AG&Co, Nümbrecht, Germany | 821,473 | |
Ultrapure deionized water | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | Synergy | |
NaCl | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 3957.2 | |
Food grade agar | AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany | A0917,5000 | |
Paintbrush (small and large) | Milan | Aquarell 310 Size 0 and 2 | |
Pyrometer | Trotec | BP20 |