Co-culturing BC Celler: Culturing brystkreft celler med bein fragmenter for å studere kreftcelle spredning

1. Kokulturerende brystkreftceller ved siden av beinfragmenter for å måle brystcelleproliferasjon ved hjelp av BLI

1. Før eksperimentet, lag en suspensjon som inneholder 2 x 10⁵ brystkreftceller / 50 μl, og lag plugger av beinvoks for immobiliserende beinfragmenter i kulturen. Klipp en P200 mikropipettespiss i 3 deler og bruk den smale enden av det største stykket på en "cookie cutter" måte å kutte små (~ 35 mg) biter av beinvoks. Bruk den brede enden av det minste stykket til å kaste ut beinvokspluggene i en Petri-tallerken for oppbevaring.
2. Plasser et stykke benvoks i klokken 12 for hver brønn, og trykk forsiktig ned med en steril pekefinger med hansker.
3. Pipette 50 μl celle suspensjon som inneholder 1 x 10⁵ brystkreftceller i DMEM-10% FBS + Pen-Strep i midten av hver brønn av en 6-brønns plate. (Alternativt frøceller i et spredt mønster hvis ønskelig.) Plasser platen i en 37 °C vevskulturinkubator i 45 minutter for å fremme celletilbehør.
4. Plasser 1 benfragment på 1 stykke benvoks for hver eksperimentelle brønn og påfør forsiktig trykk med rongeuren for å sikre den. Utfør eksperimenter i triplikat slik at 3 benfragmenter fra en gitt THR-prøve plasseres i de tre øverste brønnene, mens de tre nederste brønnene bare inneholder beinvoks som kontroller.
5. Bruk en 5 ml pipette, lever forsiktig og sakte 5 ml DMEM-10% FBS til siden av hver brønn for å unngå å løsne brystcellene eller beinfragmentene. Plasser platen i en 37 °C vevskulturinkubator i 20-24 timer.
6. For å utføre bioluminescensavbildning (BLI) fjern platen fra inkubatoren og tilsett luciferin substrat (for å oppnå en konsentrasjon på 300 μg / ml) til hver brønn. Bilde platen umiddelbart på en IVIS Imaging Platform ved hjelp av følgende parametere: f-stopp på 1, liten binning, eksponeringstid på 1 sek, nivå D. Mål signalintensiteten til hver samt gjennomsnittlig utstråling (fotoner / sekund / kvadratcentimeter / steradian).
7. Bruk bildeprogramvare til å definere regioner av interesse (ROI) for å kvantisere gjennomsnittlig utstråling for alle eksperimentelle og kontrollbrønner. Eksporter gjennomsnittlige utstrålingsverdier til et Excel-ark for å utføre statistikk og generere grafer.