BC 세포를 공동 배양: 암 세포 증식을 연구하기 위하여 뼈 파편으로 유방암 세포를 배양합니다

1. BLI를 사용하여 유방 세포 증식을 측정하기 위하여 뼈 단편에 인접한 유방암 세포를 공동 배양합니다

1. 실험에 앞서, 2 x 10⁵ 유방암 세포/50 μl을 포함하는 현탁액을 준비하고, 배양에서 뼈 조각을 고정하기 위해 뼈 왁스의 플러그를 준비한다. P200 마이크로피펫 팁을 3개로 자르고 "쿠키 커터" 방식으로 가장 큰 조각의 좁은 끝을 사용하여 뼈 왁스의 작은 (~35 mg) 조각을 잘라냅니다. 가장 작은 조각의 넓은 끝을 사용하여 뼈 왁스 플러그를 페트리 접시에 담아 보관하십시오.
2. 각 우물의 12시 위치에 뼈 왁스 조각을 놓고 멸균 장갑 검지 손가락으로 부드럽게 아래로 누릅니다.
3. DMEM-10% FBS + 펜 스트렙에서 1 x 10⁵ 유방암 세포를 함유한 세포 현탁액의 파이펫 50 μl이 6웰 플레이트의 각 웰의 중심에 있습니다. (대안적으로, 원하는 경우 분산된 패턴의 종자 세포.) 37°C 조직 배양 인큐베이터에 플레이트를 45분 동안 배치하여 세포 부착을 촉진합니다.
4. 각 실험용 골 왁스 1개에 뼈 조각 1개를 놓고, 이를 고정하기 위해 rongeur로 부드러운 압력을 가합니다. 주어진 THR 표본의 3개의 뼈 조각이 상위 3개의 우물에 배치되는 것을, 아래 3개의 우물은 대조군으로만 뼈 왁스를 포함하는 것을 triplicate에서 실험을 수행합니다.
5. 5ml 파이펫을 사용하여 유방 세포 나 뼈 조각을 탈취하지 않도록 DMEM-10 % FBS 5 ml을 부드럽고 천천히 각 우물의 측면에 전달합니다. 플레이트를 37°C 조직 배양 인큐베이터에 20-24시간 동안 배치합니다.
6. 생물 발광 이미징 (BLI)을 수행하기 위해 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 각 우물에 루시페린 기판 (300 μg /ml의 농도를 달성하기 위해)을 추가합니다. 다음 매개 변수를 사용하여 IVIS 이미징 플랫폼에서 플레이트를 즉시 이미지: f-stop 1, 작은 비닝, 1초의 노출 시간, 레벨 D. 각 의 신호 강도뿐만 아니라 평균 광채(광자/초/제곱 센티미터/스테라디아)를 측정합니다.
7. 이미징 소프트웨어를 사용하여 관심 영역(ROI)을 정의하여 모든 실험 및 제어 우물의 평균 광채를 양화합니다. 평균 광채 값을 Excel 시트로 내보내 통계를 수행하고 그래프를 생성합니다.