Co-coltivare cellule BC: coltivare cellule tumorali del seno con frammenti ossei per studiare la proliferazione delle cellule tumorali

1. Co-coltivare cellule tumorali del seno adiacenti a frammenti ossei per misurare la proliferazione delle cellule mammari utilizzando BLI

1. Prima dell'esperimento, preparare una sospensione contenente 2 x 10^{5 cellule} tumorali del seno/50 μl e preparare tappi di cera ossea per immobilizzare i frammenti ossei in coltura. Tagliare una punta in micropipetta P200 in 3 pezzi e utilizzare l'estremità stretta del pezzo più grande in modo "cookie cutter" per tagliare piccoli pezzi (~ 35 mg) di cera ossea. Utilizzare l'estremità larga del pezzo più piccolo per espellere i tappi di cera ossea in una piastra di Petri per la conservazione.
2. Posizionare un pezzo di cera ossea a ore 12 di ogni pozzo e premere delicatamente verso il basso con un dito indice guantato sterile.
3. Pipetta 50 μl di sospensione cellulare contenente 1 x 10^{5 cellule} tumorali del seno in DMEM-10% FBS + Pen-Strep al centro di ogni pozzo di una piastra da 6 porri. In alternativa, se lo si desidera, le cellule di semi in un modello disperso. Posizionare la piastra in un incubatore di coltura tissutale a 37 °C per 45 minuti per promuovere l'attacco cellulare.
4. Posizionare 1 frammento osseo su 1 pezzo di cera ossea per ogni pozzo sperimentale e applicare una leggera pressione con il rongeur per fissarlo. Eseguire esperimenti in triplice copia in modo tale che 3 frammenti ossei di un dato campione di THR siano collocati nei primi tre pozzi, mentre i tre pozzi inferiori contengono cera ossea solo come controlli.
5. Utilizzando una pipetta da 5 ml, esettare delicatamente e lentamente 5 ml di DMEM-10% FBS sul lato di ogni pozzo per evitare lo slogare le cellule mammari o i frammenti ossei. Posizionare la piastra in un incubatore di coltura tissutale a 37 °C per 20-24 ore.
6. Per eseguire l'imaging a bioluminescenza (BLI) rimuovere la piastra dall'incubatore e aggiungere il substrato di luciferina (per ottenere una concentrazione di 300 μg/ml) ad ogni pozzo. Immagini la piastra immediatamente su una piattaforma di imaging IVIS utilizzando i seguenti parametri: f-stop di 1, piccolo binning, tempo di esposizione di 1 sec, livello D. Misura l'intensità del segnale di ciascuno e la luminosità media (fotoni / secondo / centimetro quadrato / steradiano).
7. Utilizzare il software di imaging per definire le regioni di interesse (ROI) per quantificare la luminosità media per tutti i pozzi sperimentali e di controllo. Esportare i valori medi di luminosità in un foglio di Excel per eseguire statistiche e generare grafici.