3D-samkultur med direkt interaktion: Samkulturande cancerceller med monocyter för att studera deras interaktion

Till att börja med, tillsätt DQ kollagen IV, ett fluorescerande färgämne släckt protein substrat i en extracellulär matris extrakt eller ECME. Häll detta extrakt i varje brunn i en två brunnsbild. Märk den första brunnen som samkultur, andra som kontroll. Tillsätt en lämplig mängd fluorescerande märkt cancercellsupphängning i brunnar och inkubera bilden vid 37 grader Celsius under önskad tid för att främja cellfäste.

Tillsätt en önskad mängd monocyter cell suspension till den första brunnen. Låt ECME stelna vid 37 grader Celsius. Häll lika förhållanden av cancercells- och monocytkulturmedier i varje brunn och inkubera glidningen vid 37 grader Celsius under önskad varaktighet i en koldioxidmiljö. I samkulturbrunnen utsöndrar cancerceller proteiner som monocyter kemoattraktivt protein för att locka monocyter.

Monocyter producerar däremot matrismetalloproteinas eller MMP, för att bryta ner kollagenet och främja cancercellsinvasion. Observera bilden under ett konfokalt mikroskop. DQ-kollagennedbrytningen avger fluorescens som kan ses mer i de samkulturella cellerna som indikerar cellinteraktion, medan mindre i kontrollceller. I följande protokoll kommer vi att samkulturella bröstcancerceller med monocyter för att studera deras interaktion.

För att märka BRC-celler och monocyter med kommersiellt tillgänglig kumarin och rhodamin före cellkultur, bered ett monoskikt på två gånger 10 till de sex BRC-celler av intresse och ersatte standardmediet med tillräcklig förvärmd arbetslösning av fluorescerande färgämne. Inkubera cellerna vid 37 grader Celsius i en fuktad 5% koldioxidmiljö i 30 minuter. Aspirera sedan färglösningen och använd tillräckligt med 1x PBS för att försiktigt skölja cellerna.

Aspirera PBS och lägg till standardmediet. För att prova på cellerna tillsätt två milliliter 0,05% trypsin och 0,48 millimolar EDTA till kolven och inkubera cellerna vid 37 grader Celsius i 5 till 10 minuter. Tillsätt 200 mikroliter FBS för att stoppa trypsiniseringen och sju milliliter motsvarande medium utan kosttillskott.

Återanvänd cellerna genom pipetting, överför sedan 10 mikroliter av cellerna till en Neubauer-kammare och räknar dem. Därefter pelletar cellerna vid 430 x g vid rumstemperatur i fem minuter, kasserar sedan supernaten och använder milliliter för förvärmd fluorescerande färglösning för att suspendera cellerna.

Inkubera cellernas suspension vid 37 grader Celsius i en fuktad 5% koldioxidmiljö i 30 minuter. Efter pelletering av cellerna igen, kassera färgningslösningen och använd 5 till 7 milliliter 1x PBS för att försiktigt återanvända cellerna. Efter att ha pelleterat cellerna igen och kasserat PBS, återanvände cellerna i 5 till 7 milliliter standardmedium.

Räkna 10 mikroliter av cellupphängningen. Skapa en samkultur genom att sprida tillräckligt med ECME längst ner i brunnen för att bilda ett jämnt lager i varje brunn i ett fyrbrunns kammarreglage. Platta 20 mikroliter av en enda cellsuspension som innehåller 5 gånger 10 till de femte märkta BRC-cellerna per brunn. Efter 15 till 20 minuter vid 37 grader Celsius, tillsätt en suspension på 2,5 gånger 10 till de femte märkta monocyterna i 80 mikroliter analysmedium, kompletterat med 60% ECME.

Låt ECME stelna 37 grader Celsius i 15 till 20 minuter. Tillsätt nu 1 milliliter av en 1:1 blandning av BRC-cellerna och monocytkulturmediet. Inkubera samkulturerna vid 37 grader Celsius i en fuktad 5% koldioxidmiljö i 24 timmar, 48 timmar eller fem dagar för att spåra förändringar vid olika tidpunkter.

För att bryta ned ECM-proteinerna och återställa cellerna från kulturerna, aspirera och kassera mediet tillsätt sedan 0,5 milliliter 1x PBS med 0,1% trypsin och 0,25% EDTA till kulturen. Inkubera cellerna vid 37 grader Celsius i tre timmar. Efter inkubationen, tillsätt 0,5 milliliter 1x PBS med 10% FBS för att neutralisera trypsin och återanvänd cellerna genom att kraftfullt pipetting för att få en enda cell suspension.

Efter pelletering av cellerna kasserade supernatanten och återanvände cellerna i fem milliliter 1x PBS med 10% FBS. Upprepa steget en gång. Försuspensionera cellen till FACS med lämpligt instrument. Se till att de slutliga populationerna är minst 95% rena.