Encyclopedia of Experiments: Cancer Research
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शुरू करने के लिए, डीक्यू कोलेजन IV, एक फ्लोरोसेंट डाई शमन प्रोटीन सब्सट्रेट को एक एक्सेलैलुलर मैट्रिक्स एक्सट्रैक्ट या ईसीएमई में जोड़ें। एक दो अच्छी तरह से स्लाइड के प्रत्येक कुएं में इस निकालने डालो। पहले अच्छी तरह से सह संस्कृति के रूप में लेबल, नियंत्रण के रूप में दूसरा । कुओं में फ्लोरोसेंटी लेबल कैंसर सेल निलंबन की एक उचित राशि जोड़ें, और सेल लगाव को बढ़ावा देने के लिए वांछित समय के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड इनक्यूबेट ।
पहले कुएं में मोनोसाइट्स सेल निलंबन की एक आवश्यक राशि जोड़ें। ECME ३७ डिग्री सेल्सियस पर जमना करते हैं । प्रत्येक अच्छी तरह से कैंसर सेल और मोनोसाइट संस्कृति मीडिया के समान अनुपात डालो और एक कार्बन डाइऑक्साइड के वातावरण में वांछित अवधि के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड इनक्यूबेट । सह-संस्कृति में अच्छी तरह से, कैंसर कोशिकाएं मोनोसाइट्स केमोटाट्रेक्टेंट प्रोटीन जैसे प्रोटीन को मोनोसाइट्स को आकर्षित करने के लिए स्रावित करती हैं।
इसके विपरीत, मोनोसाइट्स कैंसर कोशिकाओं के आक्रमण को बढ़ावा देने, कोलेजन को नीचा दिखाने के लिए मैट्रिक्स मेटललोप्रोटीज़ या एमएमपी का उत्पादन करते हैं। एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत स्लाइड देखें। DQ कोलेजन क्षरण फ्लोरेसेंस उत्सर्जित करता है जिसे कोशिका संपर्क का संकेत देने वाली सह-संस्कृति कोशिकाओं में अधिक देखा जा सकता है, जबकि नियंत्रण कोशिकाओं में कम। निम्नलिखित प्रोटोकॉल में, हम उनकी बातचीत का अध्ययन करने के लिए मोनोसाइट्स के साथ स्तन कैंसर कोशिकाओं को सह-संस्कृति देंगे।
सेल संस्कृति से पहले व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कूमारिन और रोडामाइन के साथ बीआरसी कोशिकाओं और मोनोसाइट्स को लेबल करने के लिए, ब्याज की छह बीआरसी कोशिकाओं को दो गुना 10 का मोनोलेयर तैयार करें और फ्लोरोसेंट डाई के पर्याप्त प्रीवार्म्ड वर्किंग सॉल्यूशन के साथ मानक माध्यम को प्रतिस्थापित करें। 30 मिनट के लिए एक आर्द्र 5% कार्बन डाइऑक्साइड के वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। फिर डाई समाधान को एस्पिरेट करें और कोशिकाओं को धीरे-धीरे कुल्ला करने के लिए पर्याप्त 1x पीबीएस का उपयोग करें।
पीबीएस को एस्पिरेट करें और मानक माध्यम जोड़ें। कोशिकाओं को ट्रिपसिनाइज करने के लिए फ्लास्क में 0.05% ट्राइप्सिन और 0.48 मिलीमोलर ईडीटीए के दो मिलीलीटर जोड़ें, और कोशिकाओं को 5 से 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। पूरक के बिना ट्रिप्सिनाइजेशन और संबंधित माध्यम के सात मिलीलीटर को रोकने के लिए एफबीएस के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें।
कोशिकाओं को पिपिंग करके फिर से खर्च करें, फिर कोशिकाओं के 10 माइक्रोलीटर को एक न्यूबॉयर कक्ष में स्थानांतरित करें और उन्हें गिनें। इसके बाद, पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 430 x ग्राम पर कोशिकाओं को गोली दें, फिर सुपरनैट को त्यागें और कोशिकाओं को निलंबित करने के लिए प्रीवार्म्ड फ्लोरोसेंट डाई वर्किंग सॉल्यूशन के मिलीलीटर का उपयोग करें।
कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए एक आर्द्र 5% कार्बन डाइऑक्साइड के वातावरण में ३७ डिग्री सेल्सियस पर निलंबन इनक्यूबेट । कोशिकाओं को फिर से गोली मारने के बाद, डाई वर्किंग सॉल्यूशन को त्यागें और कोशिकाओं को धीरे-धीरे निलंबित करने के लिए 1x पीबीएस के 5 से 7 मिलीलीटर का उपयोग करें। फिर कोशिकाओं को एक बार फिर से गोली मारने और पीबीएस को त्यागने के बाद, मानक माध्यम के 5 से 7 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित कर दिया।
सेल सस्पेंशन के 10 माइक्रोलीटर गिनें। एक चार अच्छी तरह से चैंबर स्लाइड प्रणाली के प्रत्येक कुएं में एक भी परत बनाने के लिए अच्छी तरह से नीचे पर्याप्त ECME प्रसार द्वारा एक सह संस्कृति की स्थापना की । प्लेट एक एकल सेल निलंबन के 20 माइक्रोलीटर जिसमें 5 गुना 10 से पांचवें लेबल वाली बीआरसी कोशिकाएं प्रति अच्छी तरह से होती हैं। 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 से 20 मिनट के बाद, परख माध्यम के 80 माइक्रोलीटर में पांचवें लेबल मोनोसाइट्स के लिए 2.5 गुना 10 का निलंबन जोड़ें, 60% ईसीएमई के साथ पूरक।
ECME को 15 से 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस जमना की अनुमति दें। अब, बीआरसी कोशिकाओं और मोनोसाइट संस्कृति माध्यम के 1:1 मिश्रण के 1 मिलीलीटर जोड़ें। विभिन्न समय बिंदुओं पर परिवर्तन को ट्रैक करने के लिए 24 घंटे, ४८ घंटे या पांच दिनों के लिए एक आर्द्रीकृत 5% कार्बन डाइऑक्साइड के वातावरण में ३७ डिग्री सेल्सियस पर सह संस्कृतियों को इनक्यूबेट करें ।
ईसीएम प्रोटीन को नीचा दिखाने और संस्कृतियों से कोशिकाओं को ठीक करने के लिए, माध्यम को एस्पिरेट और त्यागें फिर संस्कृति में 0.1% ट्राइप्सिन और 0.25% ईडीटीए के साथ 1x पीबीएस के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें। कोशिकाओं को तीन घंटे तक 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, ट्राइप्सिन को बेअसर करने और एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए सख्ती से पाइपिंग करके कोशिकाओं को फिर से खर्च करने के लिए 10% एफबीएस के साथ 1x पीबीएस के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें।
कोशिकाओं को गोली लगाने के बाद, सुपरनैट को त्यागें और 10% एफबीएस के साथ 1x पीबीएस के पांच मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित कर दें। एक बार स्टेप दोहराएं। उचित साधन के साथ FACS के लिए सेल निलंबन विषय। सुनिश्चित करें कि अंतिम आबादी कम से कम 95% शुद्ध हैं।
