3D-Co-Kultur mit direkter Interaktion: Co-Culturing Cancer Cells mit Monozyten, um ihre Interaktion zu studieren

Zu Beginn fügen Sie DQ-Kollagen IV, ein fluoreszierendes Farbstoff abgeschrecktes Proteinsubstrat, in einen extrazellulären Matrixextrakt oder ECME ein. Gießen Sie diesen Extrakt in jeden Brunnen einer zwei Brunnenrutsche. Beschriften Sie die erste sowie Co-Kultur, zweitens als Kontrolle. Fügen Sie eine angemessene Menge an fluoreszierend markierter Krebszellsuspension in Brunnen hinzu und inkubieren Sie die Rutsche bei 37 Grad Celsius für die gewünschte Zeit, um die Zellanhaftung zu fördern.

Fügen Sie dem ersten Brunnen eine erforderliche Menge an Monozyten-Zellsuspension hinzu. Lassen Sie die ECME bei 37 Grad Celsius verfestigen. Gießen Sie gleiche Verhältnisse von Krebszell- und Monozytenkulturmedien in jeden Brunnen und inkubieren Sie die Rutsche bei 37 Grad Celsius für die gewünschte Dauer in einer Kohlendioxid-Umgebung. In der Kokultur gut, Krebszellen sezernieren Proteine wie Monozyten Chemoattractant Protein Monozyten anziehen.

Im Gegensatz dazu produzieren Monozyten Matrix-Metalloproteinase oder MMP, um das Kollagen zu degradieren und die Invasion von Krebszellen zu fördern. Beobachten Sie das Dia unter einem konfokalen Mikroskop. Der DQ-Kollagenabbau emittiert Fluoreszenz, die mehr in den Kokulturzellen gesehen werden kann, die auf eine Zellinteraktion hinweisen, während sie in Kontrollzellen weniger enthalten ist. Im folgenden Protokoll werden wir Brustkrebszellen mit Monozyten mitkulturen, um deren Wechselwirkung zu untersuchen.

Um BRC-Zellen und Monozyten vor der Zellkultur mit handelsüblichem Cumarin und Rhodalin zu kennzeichnen, bereiten Sie eine Monoschicht von zwei mal 10 auf die sechs BRC-Zellen von Interesse vor und ersetzen das Standardmedium durch eine ausreichende vorgewärmte Arbeitslösung des Fluoreszenzfarbstoffs. Inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten 5% Kohlendioxidumgebung. Dann die Farbstofflösung ansaugen und ausreichend 1x PBS verwenden, um die Zellen vorsichtig zu spülen.

Aspirieren Sie die PBS und fügen Sie das Standardmedium hinzu. Um die Zellen zu versuchen, fügen Sie zwei Milliliter 0,05% Trypsin und 0,48 Millimolar EDTA in den Kolben, und inkubieren die Zellen bei 37 Grad Celsius für 5 bis 10 Minuten. Fügen Sie 200 Mikroliter FBS, um die Trypsinisierung zu stoppen und sieben Milliliter des entsprechenden Mediums ohne Ergänzungen.

Die Zellen durch Pipettieren wieder aufsetzen, dann 10 Mikroliter der Zellen in eine Neubauer-Kammer übertragen und zählen. Als nächstes pellet die Zellen bei Raumtemperatur für fünf Minuten bei 430 x g, dann verwerfen Sie den Überstand und verwenden Milliliter vorgewärmter Fluoreszenzfarbstoff-Arbeitslösung, um die Zellen aufzuhängen.

Inkubieren Sie die Zellen Suspension bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten 5% Kohlendioxid-Umgebung für 30 Minuten. Nach dem erneuten Granulieren der Zellen entsorgen Sie die Farbstoffarbeitslösung und verwenden Sie 5 bis 7 Milliliter 1x PBS, um die Zellen vorsichtig zu resuspendieren. Nach dem erneuten Pelletieren der Zellen und dem Wegwerfen der PBS resuspendedn die Zellen in 5 bis 7 Milliliter Standardmedium.

Zählen Sie 10 Mikroliter der Zellsuspension. Richten Sie eine Co-Kultur ein, indem Sie genügend ECME am unteren Rand des Brunnens verteilen, um in jedem Brunnen eines Vier-Well-Kammer-Schiebesystems eine gleichmäßige Schicht zu bilden. Platte 20 Mikroliter einer Einzelzellsuspension, die 5 mal 10 bis zur fünften markierten BRC-Zellen pro Brunnen enthält. Nach 15 bis 20 Minuten bei 37 Grad Celsius eine Suspension von 2,5 mal 10 zu den fünften markierten Monozyten in 80 Mikroliter Assaymedium hinzufügen, ergänzt mit 60% ECME.

Lassen Sie das ECME 15 bis 20 Minuten 37 Grad Celsius verfestigen. Fügen Sie nun 1 Milliliter einer 1:1-Mischung aus den BRC-Zellen und dem Monozytenkulturmedium hinzu. Inkubieren Sie die Kokulturen bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten 5% Kohlendioxid-Umgebung für 24 Stunden, 48 Stunden oder fünf Tage, um Veränderungen zu verschiedenen Zeitpunkten zu verfolgen.

Um die ECM-Proteine zu abbauen und die Zellen aus den Kulturen zurückzugewinnen, aspirieren und entsorgen Sie das Medium und fügen Sie 0,5 Milliliter 1x PBS mit 0,1% Trypsin und 0,25% EDTA zur Kultur hinzu. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für drei Stunden. Nach der Inkubation 0,5 Milliliter 1x PBS mit 10% FBS hinzufügen, um das Trypsin zu neutralisieren und die Zellen durch kräftiges Pipetieren wieder aufzuhängen, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten.

Nach dem Pelletieren der Zellen, entsorgen Sie den Überstand und resuspended die Zellen in fünf Milliliter 1x PBS mit 10% FBS. Wiederholen Sie den Schritt einmal. Unterziehen Sie die Zellsuspension FACS mit dem entsprechenden Instrument. Stellen Sie sicher, dass die Endpopulationen zu mindestens 95 % rein sind.