3D Co-kultur med direkte interaktion: Co-dyrkning kræftceller med monocytter til at studere deres interaktion

Til at begynde med tilsættes DQ kollagen IV, et fluorescerende farvestof slukket protein substrat i en ekstracellulær matrix ekstrakt eller ECME. Hæld dette ekstrakt i hver brønd af en to godt dias. Mærk den første såvel som samkultur, for det andet som kontrol. Tilføj en passende mængde fluorescerende mærket kræft celle suspension i brønde, og inkuber diaset ved 37 grader Celsius for den ønskede tid til at fremme celle vedhæftet fil.

Tilføj en nødvendig mængde monocytter celle suspension til den første brønd. Lad ECME størkne ved 37 grader Celsius. Hæld lige nøgletal for kræftcelle og monocytkultur medier i hver brønd og inkuber diaset ved 37 grader Celsius for den ønskede varighed i et kuldioxidmiljø. I co-kultur godt, udskiller kræftceller proteiner såsom monocytter kemoattratant protein til at tiltrække monocytter.

I modsætning hertil producerer monocytter matrix metalloproteinase eller MMP, for at nedbryde kollagen, fremme kræftceller invasion. Overhold diaset under et konfokalt mikroskop. DQ kollagen nedbrydning udsender fluorescens, som kan ses mere i co-kultur celler, der angiver celle interaktion, mens mindre i kontrol celler. I den følgende protokol, vil vi co-kultur brystkræftceller med monocytter til at studere deres interaktion.

At mærke BRC-celler og monocytter med kommercielt tilgængelige cumarin og rhodamin før cellekultur, forberede et monolag på to gange 10 til de seks BRC-celler af interesse og erstatte standardmediet med tilstrækkelig forvarmet arbejdsopløsning af det fluorescerende farvestof. Inkuber cellerne ved 37 grader Celsius i et befugtet 5% kuldioxidmiljø i 30 minutter. Derefter indsug farveopløsningen og brug tilstrækkelig 1x PBS til forsigtigt at skylle cellerne.

Indsug PBS og tilsæt standardmediet. For at trypsinisere cellerne tilsættes to milliliter på 0,05% trypsin og 0,48 millimolar EDTA til kolben og inkuberes cellerne ved 37 grader Celsius i 5 til 10 minutter. Tilsæt 200 mikroliter FBS for at stoppe trypsinisering og syv milliliter af det tilsvarende medium uden kosttilskud.

Resuspend cellerne ved pipettering, derefter overføre 10 mikroliter af cellerne til en Neubauer kammer og tælle dem. Derefter pellet cellerne ved 430 x g ved stuetemperatur i fem minutter, kassér derefter supernatanten og brug milliliter af forvarmet fluorescerende farvestofarbejdsopløsning til at suspendere cellerne.

Inkuber cellerne suspension ved 37 grader Celsius i en befugtet 5% kuldioxid miljø i 30 minutter. Efter pelletering af cellerne igen kasseres farvestofarbejdsopløsningen og brug 5 til 7 milliliter 1x PBS til forsigtigt at genbruge cellerne. Så efter pelleting cellerne igen og kassere PBS, genbruges cellerne i 5 til 7 milliliter af standard medium.

Tæl 10 mikroliter af celleaffjedringen. Opsæt en co-kultur ved at sprede nok ECME i bunden af brønden til at danne et jævnt lag i hver brønd i et fire-godt kammer diassystem. Plade 20 mikroliter af en enkelt celle suspension indeholder 5 gange 10 til den femte mærket BRC celler per brønd. Efter 15 til 20 minutter ved 37 grader Celsius tilsættes en suspension på 2,5 gange 10 til den femte mærkede monocytter i 80 mikroliter assay medium, suppleret med 60% ECME.

Lad ECME størkne en 37 grader Celsius i 15 til 20 minutter. Tilsæt nu 1 milliliter af en 1:1 blanding af BRC-cellerne og monocytkulturmediet. Inkubere co-kulturer ved 37 grader Celsius i en befugtet 5% kuldioxid miljø i 24 timer, 48 timer, eller fem dage til at spore ændringer på forskellige tidspunkter.

For at nedbryde ECM-proteinerne og genvinde cellerne fra kulturerne skal du aspirere og kassere mediet og derefter tilføje 0,5 milliliter 1x PBS med 0,1% trypsin og 0,25% EDTA til kulturen. Inkuber cellerne ved 37 grader Celsius i tre timer. Efter inkubationen tilsættes 0,5 milliliter 1x PBS med 10% FBS for at neutralisere trypsin og genbruge cellerne ved kraftigt pipettering for at opnå en enkelt celleaffjedring.

Efter pelleting cellerne, kassér supernatant og genbruges cellerne i fem milliliter af 1x PBS med 10% FBS. Gentag trinnet én gang. Understøt celleophænget til FACS med det relevante instrument. Sørg for, at de endelige populationer er mindst 95% rene.