Caerulein과 Lipopolysaccharide의 조합을 통한 중증 급성 췌장염의 마우스 모델 준비 복강 내 주사
Summary
복강 내 약물 투여는 췌장 손상을 유발하기 위한 안전하고 효과적인 비침습적 접근법입니다. 이 연구는 다양한 정도의 췌장 손상을 유발하기 위해 마우스에 대한 5가지 고유한 복강 내 주사 프로토콜을 비교하고 중증 급성 췌장염(SAP)에 대한 병리학적 변화와 치료 전략을 조사하기 위해 중증 췌장 손상 모델을 설정했습니다.
Abstract
사망률이 높은 중증 급성 췌장염(SAP)의 치료는 임상적으로 중대한 과제입니다. 동물 모델을 사용하여 SAP와 관련된 병리학적 변화를 조사하면 잠재적인 치료 표적을 식별하고 새로운 치료 접근법을 탐색하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이전 연구에서는 주로 소듐 타비아우로콜레이트의 역행성 담관 주입을 통해 췌장 손상을 유발했지만, 수술 손상이 동물 모델의 품질에 미치는 영향은 아직 불분명합니다. 이 연구에서는 C57BL/6J 마우스에서 췌장 손상을 유발하기 위해 다양한 빈도의 복강 내 Caerulein 주사와 다양한 용량의 LPS를 결합한 주사를 사용하고 5가지 복강 내 주사 프로토콜에 걸쳐 손상 정도를 비교했습니다. 마우스에서 급성 췌장염을 유발하는 것과 관련하여, 5일 이내에 80%의 높은 사망률을 초래하는 복강 내 주사 프로토콜이 제안됩니다. 구체적으로, 마우스는 Caerulein(50μg/kg)을 매일 10회 복강내 주사한 후, 마지막 Caerulein 투여 1시간 후에 LPS(15mg/kg)를 주사했습니다. 주사 약물의 빈도와 복용량을 조절함으로써 췌장 손상의 중증도를 효과적으로 조절할 수 있습니다. 이 모델은 제어성이 뛰어나고 복제 주기가 짧아 고가의 장비 없이도 한 명의 연구자가 완성할 수 있습니다. 인간 SAP에서 관찰된 주요 질병 특성을 편리하고 정확하게 시뮬레이션하는 동시에 높은 수준의 재현성을 입증합니다.
Introduction
중증 급성 췌장염은 소화기 계통 질환 영역 내에서 빠른 발병, 빠른 진행, 높은 사망률을 특징으로 한다1. 높은 치사율은 항상 임상 연구의 주요 초점이었습니다. 임상 조건의 예측할 수 없는 변화, 질병 증상의 이질성, 인간 표본의 제한된 가용성으로 인해 동물 모델을 확립하는 것이 질병 연구에서 점점 더 중요해지고 있습니다.
소듐 타우로콜레이트를 총담관에 역행성 주입하는 것은 일반적으로 SAP2의 랫트 모델을 만드는 데 사용됩니다. 이 모델링 기법은 췌장 담도 폐쇄를 시뮬레이션하고 담즙 및 췌장액의 역류를 유도함으로써 SAP 동물 모델 복제에서 높은 성공률을 보여줍니다. 그러나 침습적 수술은 동물 모델 자체에 영향을 미친다는 점에 유의해야 합니다. 또한, 이 방법은 주로 실험 대상으로 사용되는 쥐 및 개와 같은 대형 동물에 국한됩니다. 십이지장 삽관(duodenal intubation)3, 직접 십이지장 천자(direct duodenal puncture)4 및 담관-췌관관(bile duct-pancreatic duct)5의 직접 천자를 포함한 대체 기법이 모델링 목적으로 자주 활용된다.
복강 내 주사 및 식이 모델링 방법은 모든 크기의 동물에 적용할 수 있는 비침습적 이점을 제공합니다. 콜린 결핍 에티오닌(CDE)6을 공급하여 유도된 SAP의 마우스 모델은 조절이 잘 불가능한 고혈당증 및 저칼슘혈증과 같은 특정 합병증을 나타내므로 새로운 진단 및 치료 접근법을 평가하기에 적합하지 않습니다. 한편, L-아르기닌7과 결합된 Caerulein의 복강내 주사는 마우스에서 급성 췌장염을 유발하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 방법을 나타냅니다. 특히, 콜레시스토키닌 유사체인 Caerulein의 반복적인 복강 내 투여는 발병기전, 염증 및 재생 과정을 포함하여 이 파괴적인 질병과 관련된 다양한 측면을 조사하는 데 매우 적합한 접근 방식을 제공합니다. 콜레시스토키닌(cholecystokinin, CCK)과의 구조적 유사성으로 인해 카에룰레인은 담낭 수축과 췌장 효소 분비를 효과적으로 자극하여 효소 분비의 불균형을 초래하고 이후 자기 파괴를 일으킨다8. 유비쿼터스이며 병원체 관련 분자 패턴 분자로 광범위하게 연구된 LPS(Lipopolysaccharide)는 복강 내 주입을 통해 Caerulein과 결합하여 SAP의 효과적인 마우스 모델을 확립할 수 있습니다. 이 조합은 상당한 수의 염증성 사이토카인을 빠르게 유발하고 방출하여 과도한 국소 및 전신 염증을 유발합니다. 여러 연구에서 LPS와 결합된 Caerulein의 복강 내 주입을 통해 마우스에서 SAP 모델을 유도했다고 보고했습니다. 이는 Caerulein의 복강 내 주사가 마우스에서 췌장 부종과 출혈을 유발할 수 있는 반면, LPS를 추가하면 즉시 췌장 괴사를 유발하고 전신 염증 반응, 패혈증 및 심지어 장기 부전을 악화시킬 수 있다는 사실에 기인할 수 있습니다. 현재 복강내 Caerulein 주사의 용량과 빈도에 차이가 있을 뿐만 아니라 추가 LPS 용량에도 불일치가 있습니다. 마우스 SAP 모델에서 일관성을 달성하는 것은 도전적입니다 9,10,11,12; 따라서 이상적인 모델을 얻기 위해 표준화된 프로토콜을 수립할 필요가 있습니다. 이 기사에서는 마우스의 복강 내 주사를 위한 프로토콜을 설명하고 LPS의 최적 주입 빈도와 추가 투여량을 조사합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
현재 중증 급성 췌장염 환자의 높은 사망률을 개선할 수 있는 효과적인 수단이 부족합니다. 면역 안정성 기전을 향상시키는 약물의 효능을 조사하는 것이 중요합니다. 중증 급성 췌장염에 대한 이상적인 동물 모델이 시급히 필요합니다. C57BL/6J 유전적 배경을 가진 마우스는 SAP 병태생리학 연구를 포함한 생물의학 연구에 널리 사용됩니다. B6J 마우스에서 70년 이상 진행된 유전적 분화로 인해 여러 …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 Huainan City의 건강 및 의료 과학 연구 프로젝트(No. HNWJ2023005); Huainan City의 시립 지도 과학 기술 계획 프로그램(No.2023151); Anhui Provincial College 학생들의 혁신 및 기업가 정신 교육 프로그램 (No. S202310361254); “50· Stars of Science and Technology” 화이난시와 안후이성 핵심 임상 전문 건설 프로젝트의 혁신 팀. 관련 테스트 데이터를 제공해 주신 Anhui University of Science and Technology의 First Affiliated Hospital 실험실 부서에 감사를 표하고 싶습니다.
Materials
| 20× Citric Acid Antigen Repair Solution (pH 6.0) | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1202-250 ml | |
| Amylase | Mindray,China | ||
| Annexin V-FITC/PI | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1511 | diluted at 1:20 |
| Anti-HMGB1 Rabbit pAB | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GB11103 | diluted at 1:1800 |
| BCA protein quantitative detection kit | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G2026-200T | |
| BD FACSCanto II Flow Cytometer | BD Life Sciences, San Jose, CA, 95131, USA | BD FACSCanto II | |
| BSA | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GC305010-100g | |
| C57BL/6J | Cavion Experimental Animal Co., Changzhou, China | license number SCXY (Su) 2011–0003 | |
| Ceruletide | MCE, New Jersey, USA | 17650-98-5 | 50 µg/kg |
| Chemiluminescence imager | Cytiva CO.,LTD.;USA | ||
| Citric acid antigen repair Solution (Dry powder pH 6.0) | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1201-5 L | |
| Collagenase IV | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GC305014 | 0.5 mg/mL |
| DAB (SA-HRP) Tunel Cell Apoptosis Detection Kit | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1507-100 T | |
| Dimension EXL with LM Integrated Chemistry System | Siemens Healthcare Diagnostics Inc.Brookfield,USA | YZB/USA 8311-2014 | |
| ECL developer | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | ||
| Eosin dye (alcohol soluble) | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1001-100 ml | |
| EthoVision XT | Noldus, Netherlands | ||
| FITC-labeled goat anti-rabbit IgG | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GB22303 | diluted at 1:50 |
| Fully automatic blood cell analyzer | Zybio Inc. China | Zybio-Z3 CRP | |
| GapDH | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GB11103 | diluted at 1:1500 |
| Hematoxylin blue return solution | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1040-500 ml | |
| Hematoxylin differentiation solution | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1039-500 ml | |
| Hematoxylin dye | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1004-100 ml | |
| HMGB-1 ELISA kits | njjcbio Co., Ltd, China | ||
| HOMOGENIZER | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | KZ-III-F;IC111150 100222 | |
| HRP-labeled goat anti-rabbit IgG | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GB23303 | diluted at 1:1500 |
| IL-6 ELISA kits | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GEM0001 | |
| Lipase | Mindray,China | ||
| Lipopolysaccharide | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GC205009 | 15 mg/kg |
| Low temperature high speed centrifuge | Changsha Pingfan Apparatus&Instrument Co.,Ltd.,China | TGL-20M | |
| Membrane breaking liquid | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1204 | |
| microtome | Jinhua Craftek Instrument Co., Ltd.;China | CR-601ST | |
| Nylon mesh | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | 200-mesh | |
| One-step TUNEL cell apoptosis detection kit (DAB staining method) | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1507-100T | |
| Paraffin tissue embedding machine | PRECISION MEDICAL INSTRUMENTS CO.,LTD;Changzhou,China | PBM-A | |
| Pathological tissue drying apparatus | PRECISION MEDICAL INSTRUMENTS CO.,LTD;Changzhou,China | PHY-III | |
| Phosphate-buffered saline | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G4202-100ML | |
| PMSF | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G2008-1 ml | |
| Positive fluorescence microscope | Olympus Corporation,Tokyo, Japan | BX53 | |
| Pro Calcitonin | Mindray,China | ||
| PVDF membrane | Millipore, USA | 0.22 µm | |
| RIPA | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G2002-100 ml | |
| SDS-PAGE | Beyotime Biotechnology,China | P0012A | |
| TNF-αELISA kits | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GEM0004 | |
| Ultrasonic water bath | DONGGUAN KQAO ULTRASONIC EQUIPMENT CO.,LTD.;China | KQ-200KDE | |
| Western Blot | Bio-Rad Laboratories, Inc.,USA | ||
| Western blot imaging System | Global Life Sciences IP Holdco LLC, JAPAN | Amersham ImageQuant 800 | |
| Whirlpool mixer | SCILOGEX;USA |
Referencias
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