Preparazione di un modello murino di pancreatite acuta grave tramite una combinazione di iniezione intraperitoneale di ceruleina e lipopolisaccaride
Summary
La somministrazione intraperitoneale di farmaci è un approccio non invasivo sicuro ed efficace per indurre lesioni pancreatiche. Questo studio ha confrontato cinque distinti protocolli di iniezione intraperitoneale sui topi per indurre vari gradi di danno pancreatico e ha stabilito un modello di grave danno pancreatico per studiare i cambiamenti patologici e le strategie di trattamento per la pancreatite acuta grave (SAP).
Abstract
Il trattamento della pancreatite acuta grave (SAP), con alti tassi di mortalità, rappresenta una sfida clinica significativa. Studiare i cambiamenti patologici associati alla SAP utilizzando modelli animali può aiutare a identificare potenziali bersagli terapeutici ed esplorare nuovi approcci terapeutici. Studi precedenti hanno indotto principalmente lesioni pancreatiche attraverso l’iniezione retrograda del dotto biliare di taviaurocolato di sodio, ma l’impatto del danno chirurgico sulla qualità del modello animale rimane poco chiaro. In questo studio, abbiamo impiegato varie frequenze di iniezioni intraperitoneali di Caeruleina combinate con diverse dosi di LPS per indurre lesioni pancreatiche nei topi C57BL/6J e abbiamo confrontato l’entità della lesione attraverso cinque protocolli di iniezione intraperitoneale. Per quanto riguarda l’induzione della pancreatite acuta nei topi, viene proposto un protocollo di iniezione intraperitoneale che si traduce in un tasso di mortalità fino all’80% entro 5 giorni. In particolare, i topi hanno ricevuto dieci iniezioni intraperitoneali giornaliere di Caerulein (50 μg/kg), seguite da un’iniezione di LPS (15 mg/kg) un’ora dopo l’ultima somministrazione di Caerulein. Regolando la frequenza e il dosaggio dei farmaci iniettati, è possibile manipolare efficacemente la gravità del danno pancreatico. Questo modello presenta una forte controllabilità e ha un ciclo di replica breve, che lo rende fattibile per il completamento da parte di un singolo ricercatore senza richiedere attrezzature costose. Simula in modo pratico e accurato le caratteristiche chiave della malattia osservate nella SAP umana, dimostrando al contempo un alto grado di riproducibilità.
Introduction
La pancreatite acuta grave è caratterizzata da una rapida insorgenza, una rapida progressione e alti tassi di mortalità all’interno del dominio1 della malattia dell’apparato digerente. Il suo alto tasso di mortalità è sempre stato al centro dell’attenzione della ricerca clinica. A causa dei cambiamenti imprevedibili delle condizioni cliniche, dell’eterogeneità delle manifestazioni della malattia e della limitata disponibilità di campioni umani, la creazione di modelli animali è diventata sempre più cruciale per la ricerca sulle malattie.
L’iniezione retrograda di taurocolato di sodio nel dotto biliare comune è comunemente usata per creare un modello di ratto di SAP2. Simulando l’ostruzione pancreatico-biliare e inducendo il reflusso della bile e del liquido pancreatico, questa tecnica di modellazione mostra un alto tasso di successo nella replicazione di modelli animali SAP. Tuttavia, va notato che la chirurgia invasiva ha un impatto sul modello animale stesso. Inoltre, questo metodo è limitato agli animali più grandi, come ratti e cani, che vengono utilizzati principalmente come soggetti sperimentali. Tecniche alternative, tra cui l’intubazione duodenale3, la puntura duodenale diretta4 e la puntura diretta del dotto biliare-dotto pancreatico5, sono spesso utilizzate a scopo di modellazione.
L’iniezione intraperitoneale e i metodi di modellazione dietetica offrono vantaggi non invasivi che possono essere applicati ad animali di qualsiasi taglia. Il modello murino di SAP indotto dall’alimentazione con colina-deficiente-etionina (CDE)6 presenta alcune complicanze, come iperglicemia scarsamente controllabile e ipocalcemia, che lo rendono inadatto per valutare nuovi approcci diagnostici e terapeutici. D’altra parte, l’iniezione intraperitoneale di Caeruleina combinata con L-arginina7 rappresenta il metodo più comunemente impiegato per indurre la pancreatite acuta nei topi. In particolare, la somministrazione ripetuta intraperitoneale di Caeruleina, un analogo della colecistochinina, fornisce un approccio altamente adatto per studiare vari aspetti correlati a questa malattia distruttiva, tra cui la patogenesi, l’infiammazione e i processi di rigenerazione. A causa della sua somiglianza strutturale con la colecistochinina (CCK), la caeruleina stimola efficacemente la contrazione della cistifellea e la secrezione enzimatica pancreatica, portando a uno squilibrio nella secrezione enzimatica seguito da una successiva autodistruzione8. Il lipopolisaccaride (LPS), essendo ubiquitario e ampiamente studiato come molecola di pattern molecolare associato a patogeni, può essere combinato con la caeruleina tramite iniezione intraperitoneale per stabilire un modello efficace di SAP nei topi. Questa combinazione innesca e rilascia rapidamente un numero significativo di citochine infiammatorie, con conseguente eccessiva infiammazione locale e sistemica. Diversi studi hanno riportato l’induzione di modelli SAP nei topi attraverso l’iniezione intraperitoneale di Caeruleina combinata con LPS. Ciò può essere attribuito al fatto che l’iniezione intraperitoneale di ceruleina può causare edema pancreatico ed emorragia nei topi, mentre l’aggiunta di LPS può indurre immediatamente necrosi pancreatica ed esacerbare la risposta infiammatoria sistemica, la sepsi e persino l’insufficienza d’organo. Attualmente, vi è una variazione nel dosaggio e nella frequenza delle iniezioni intraperitoneali di Caeruleina, nonché un’incoerenza nel dosaggio aggiuntivo di LPS. Raggiungere la coerenza nei modelli SAP del topo è impegnativo 9,10,11,12; Pertanto, è necessario stabilire un protocollo standardizzato per ottenere un modello ideale. In questo articolo, descriviamo un protocollo per l’iniezione intraperitoneale nei topi e studiamo la frequenza di iniezione ottimale e il dosaggio aggiuntivo di LPS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Attualmente, mancano mezzi efficaci per migliorare l’alto tasso di mortalità nei pazienti con pancreatite acuta grave. È fondamentale studiare l’efficacia dei farmaci nel migliorare i meccanismi di stabilità immunitaria. Esiste un urgente bisogno di un modello animale ideale per la pancreatite acuta grave. I topi con un background genetico C57BL/6J sono ampiamente utilizzati nella ricerca biomedica, compresi gli studi sulla fisiopatologia SAP. Oltre 70 anni di differenziazione genetica nei topi B6J hanno portato alla …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto da Progetti di ricerca in salute e scienze mediche nella città di Huainan (n. HNWJ2023005); Programma di guida municipale per la scienza e la tecnologia nella città di Huainan (n. 2023151); Programma di formazione per l’innovazione e l’imprenditorialità degli studenti dell’Anhui Provincial College (n. S202310361254); Il nono lotto del “50· Stars of Science and Technology” team di innovazione nella città di Huainan e nel progetto di costruzione di specialità cliniche chiave provinciali di Anhui. Vorremmo esprimere la nostra gratitudine al Dipartimento di Laboratorio del Primo Ospedale Affiliato dell’Università di Scienza e Tecnologia di Anhui per aver fornito i dati dei test pertinenti.
Materials
| 20× Citric Acid Antigen Repair Solution (pH 6.0) | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1202-250 ml | |
| Amylase | Mindray,China | ||
| Annexin V-FITC/PI | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1511 | diluted at 1:20 |
| Anti-HMGB1 Rabbit pAB | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GB11103 | diluted at 1:1800 |
| BCA protein quantitative detection kit | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G2026-200T | |
| BD FACSCanto II Flow Cytometer | BD Life Sciences, San Jose, CA, 95131, USA | BD FACSCanto II | |
| BSA | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GC305010-100g | |
| C57BL/6J | Cavion Experimental Animal Co., Changzhou, China | license number SCXY (Su) 2011–0003 | |
| Ceruletide | MCE, New Jersey, USA | 17650-98-5 | 50 µg/kg |
| Chemiluminescence imager | Cytiva CO.,LTD.;USA | ||
| Citric acid antigen repair Solution (Dry powder pH 6.0) | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1201-5 L | |
| Collagenase IV | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GC305014 | 0.5 mg/mL |
| DAB (SA-HRP) Tunel Cell Apoptosis Detection Kit | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1507-100 T | |
| Dimension EXL with LM Integrated Chemistry System | Siemens Healthcare Diagnostics Inc.Brookfield,USA | YZB/USA 8311-2014 | |
| ECL developer | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | ||
| Eosin dye (alcohol soluble) | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1001-100 ml | |
| EthoVision XT | Noldus, Netherlands | ||
| FITC-labeled goat anti-rabbit IgG | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GB22303 | diluted at 1:50 |
| Fully automatic blood cell analyzer | Zybio Inc. China | Zybio-Z3 CRP | |
| GapDH | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GB11103 | diluted at 1:1500 |
| Hematoxylin blue return solution | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1040-500 ml | |
| Hematoxylin differentiation solution | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1039-500 ml | |
| Hematoxylin dye | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1004-100 ml | |
| HMGB-1 ELISA kits | njjcbio Co., Ltd, China | ||
| HOMOGENIZER | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | KZ-III-F;IC111150 100222 | |
| HRP-labeled goat anti-rabbit IgG | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GB23303 | diluted at 1:1500 |
| IL-6 ELISA kits | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GEM0001 | |
| Lipase | Mindray,China | ||
| Lipopolysaccharide | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GC205009 | 15 mg/kg |
| Low temperature high speed centrifuge | Changsha Pingfan Apparatus&Instrument Co.,Ltd.,China | TGL-20M | |
| Membrane breaking liquid | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1204 | |
| microtome | Jinhua Craftek Instrument Co., Ltd.;China | CR-601ST | |
| Nylon mesh | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | 200-mesh | |
| One-step TUNEL cell apoptosis detection kit (DAB staining method) | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1507-100T | |
| Paraffin tissue embedding machine | PRECISION MEDICAL INSTRUMENTS CO.,LTD;Changzhou,China | PBM-A | |
| Pathological tissue drying apparatus | PRECISION MEDICAL INSTRUMENTS CO.,LTD;Changzhou,China | PHY-III | |
| Phosphate-buffered saline | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G4202-100ML | |
| PMSF | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G2008-1 ml | |
| Positive fluorescence microscope | Olympus Corporation,Tokyo, Japan | BX53 | |
| Pro Calcitonin | Mindray,China | ||
| PVDF membrane | Millipore, USA | 0.22 µm | |
| RIPA | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G2002-100 ml | |
| SDS-PAGE | Beyotime Biotechnology,China | P0012A | |
| TNF-αELISA kits | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GEM0004 | |
| Ultrasonic water bath | DONGGUAN KQAO ULTRASONIC EQUIPMENT CO.,LTD.;China | KQ-200KDE | |
| Western Blot | Bio-Rad Laboratories, Inc.,USA | ||
| Western blot imaging System | Global Life Sciences IP Holdco LLC, JAPAN | Amersham ImageQuant 800 | |
| Whirlpool mixer | SCILOGEX;USA |
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