הכנת מודל עכברים של דלקת לבלב חריפה חמורה באמצעות שילוב של Caerulein ו Lipopolysaccharide הזרקה intraperitoneal
Summary
מתן תרופות תוך צפקיות הוא גישה לא פולשנית בטוחה ויעילה לגרימת פגיעה בלבלב. מחקר זה השווה חמישה פרוטוקולים שונים של הזרקה תוך צפקית בעכברים כדי לגרום לדרגות שונות של פגיעה בלבלב וקבע מודל של פגיעה חמורה בלבלב כדי לחקור את השינויים הפתולוגיים ואת אסטרטגיות הטיפול בדלקת לבלב חריפה חמורה (SAP).
Abstract
הטיפול בדלקת לבלב חריפה חמורה (SAP), בעלת שיעורי תמותה גבוהים, מהווה אתגר קליני משמעותי. חקירת השינויים הפתולוגיים הקשורים ל-SAP באמצעות מודלים של בעלי חיים יכולה לסייע בזיהוי מטרות טיפוליות פוטנציאליות ובבחינת גישות טיפול חדשניות. מחקרים קודמים גרמו בעיקר לפגיעה בלבלב באמצעות הזרקת צינור מרה מדרדר של נתרן taviaurocholate, אך ההשפעה של נזק כירורגי על איכות המודל החייתי עדיין אינה ברורה. במחקר זה, השתמשנו בתדרים שונים של זריקות Caerulein תוך צפקיות בשילוב עם מינונים שונים של LPS כדי לגרום לפגיעה בלבלב בעכברי C57BL/6J והשווינו את היקף הפגיעה בחמישה פרוטוקולים של הזרקה תוך צפקית. לגבי גרימת דלקת לבלב חריפה בעכברים, מוצע פרוטוקול הזרקה תוך צפקית המביא לשיעור תמותה גבוה עד 80% תוך 5 ימים. באופן ספציפי, עכברים קיבלו עשר זריקות תוך צפקיות יומיות של Caerulein (50 מיקרוגרם / ק”ג), ולאחר מכן זריקה של LPS (15 מ”ג / ק”ג) שעה לאחר מתן Caerulein האחרון. על ידי התאמת התדירות והמינון של תרופות מוזרקות, ניתן לתפעל את חומרת הפגיעה בלבלב ביעילות. מודל זה מפגין יכולת שליטה חזקה ובעל מחזור שכפול קצר, מה שהופך אותו לריאלי להשלמתו על ידי חוקר יחיד ללא צורך בציוד יקר. הוא מדמה בנוחות ובמדויק מאפייני מחלה מרכזיים שנצפו ב- SAP האנושי תוך הפגנת רמה גבוהה של יכולת שחזור.
Introduction
דלקת לבלב חריפה חמורה מאופיינת בהתפרצות מהירה, התקדמות מהירה ושיעורי תמותה גבוהים בתחום מחלות מערכת העיכול1. שיעור התמותה הגבוה שלה תמיד היה מוקד בולט של המחקר הקליני. בשל שינויים בלתי צפויים בתנאים קליניים, הטרוגניות של ביטויי מחלות, וזמינות מוגבלת של דגימות אנושיות, ביסוס מודלים של בעלי חיים הפך חיוני יותר ויותר לחקר מחלות.
הזרקה מדרדרית של נתרן טאורוכולט לתוך צינור המרה הנפוץ משמשת בדרך כלל ליצירת מודל חולדה של SAP2. על ידי הדמיית חסימת לבלב וגרימת רפלוקס של מרה ונוזל הלבלב, טכניקת מידול זו מציגה שיעור הצלחה גבוה בשכפול מודלים של בעלי חיים SAP. עם זאת, יש לציין כי לניתוח פולשני יש השפעה על מודל בעלי החיים עצמו. יתר על כן, שיטה זו מוגבלת לבעלי חיים גדולים יותר, כגון חולדות וכלבים, המשמשים בעיקר כנבדקים ניסיוניים. טכניקות חלופיות, כולל אינטובציה בתריסריון3, ניקוב תריסריון ישיר4 וניקוב ישיר של צינור המרה-צינור לבלב5, משמשות לעתים קרובות למטרות דוגמנות.
הזרקה תוך צפקית ושיטות מידול תזונתי מציעות יתרונות לא פולשניים שניתן ליישם על בעלי חיים בכל גודל. מודל העכבר של SAP המושרה על ידי הזנת אתיונין חסר כולין (CDE)6 מציג סיבוכים מסוימים, כגון היפרגליקמיה והיפוקלצמיה שאינם ניתנים לשליטה, מה שהופך אותו ללא מתאים להערכת גישות אבחון וטיפול חדשות. מצד שני, הזרקה intraperitoneal של Caerulein בשילוב עם L-arginine7 מייצג את השיטה הנפוצה ביותר לגרימת דלקת לבלב חריפה בעכברים. באופן ספציפי, מתן intraperitoneal חוזר של Caerulein – אנלוגי cholecystokinin – מספק גישה מתאימה מאוד לחקר היבטים שונים הקשורים למחלה הרסנית זו, כולל פתוגנזה, דלקת, ותהליכי התחדשות. בשל הדמיון המבני שלו לכולציסטוקינין (CCK), Caerulein מגרה ביעילות התכווצות כיס המרה והפרשת אנזים הלבלב, מה שמוביל לחוסר איזון בהפרשת האנזים ואחריוהרס עצמי 8. Lipopolysaccharide (LPS), להיות בכל מקום נחקר בהרחבה כמולקולת דפוס מולקולרית הקשורים לפתוגן, ניתן לשלב עם Caerulein באמצעות הזרקה intraperitoneal כדי לבסס מודל עכברים יעיל של SAP. שילוב זה מעורר ומשחרר במהירות מספר משמעותי של ציטוקינים דלקתיים, וכתוצאה מכך דלקת מקומית וסיסטמית מוגזמת. מספר מחקרים דיווחו על השראת מודלים של SAP בעכברים באמצעות הזרקה תוך צפקית של Caerulein בשילוב עם LPS. ניתן לייחס זאת לעובדה כי הזרקה intraperitoneal של Caerulein יכול לגרום בצקת הלבלב ודימום בעכברים, בעוד תוספת של LPS יכול מיד לגרום נמק הלבלב להחמיר תגובה דלקתית מערכתית, אלח דם ואפילו אי ספיקת איברים. נכון לעכשיו, קיימת שונות במינון ובתדירות של זריקות Caerulein intraperitoneal, כמו גם חוסר עקביות במינון LPS נוסף. השגת עקביות במודלים של SAP עכבר היא מאתגרת 9,10,11,12; לכן, יש צורך לקבוע פרוטוקול סטנדרטי להשגת מודל אידיאלי. במאמר זה נתאר פרוטוקול להזרקה תוך צפקית בעכברים ונחקור את תדירות ההזרקה האופטימלית ואת המינון הנוסף של LPS.
Protocol
Representative Results
Discussion
כיום, חסרים אמצעים יעילים לשיפור שיעור התמותה הגבוה בחולים עם דלקת לבלב חריפה חמורה. חיוני לחקור את יעילותן של תרופות בשיפור מנגנוני היציבות החיסונית. קיים צורך דחוף במודל חייתי אידיאלי לדלקת לבלב חריפה חמורה. עכברים עם רקע גנטי C57BL/6J נמצאים בשימוש נרחב במחקר ביו-רפואי, כולל מחקרים על פתופ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי פרויקטים מחקריים בבריאות ובמדעי הרפואה בעיר Huainan (No. HNWJ2023005); תוכנית המדע והטכנולוגיה העירונית בעיר Huainan (מס ‘2023151); תוכנית הכשרת החדשנות והיזמות של סטודנטים במכללה המחוזית Anhui (מס ‘S202310361254); האצווה התשיעית של “50· כוכבי מדע וטכנולוגיה” צוותי חדשנות בעיר Huainan ופרויקט הבנייה הקליני המיוחד של Anhui Provincial. ברצוננו להביע את תודתנו למחלקת המעבדות של בית החולים המסונף הראשון של אוניברסיטת אנחווי למדע וטכנולוגיה על אספקת נתוני הבדיקה הרלוונטיים.
Materials
| 20× Citric Acid Antigen Repair Solution (pH 6.0) | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1202-250 ml | |
| Amylase | Mindray,China | ||
| Annexin V-FITC/PI | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1511 | diluted at 1:20 |
| Anti-HMGB1 Rabbit pAB | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GB11103 | diluted at 1:1800 |
| BCA protein quantitative detection kit | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G2026-200T | |
| BD FACSCanto II Flow Cytometer | BD Life Sciences, San Jose, CA, 95131, USA | BD FACSCanto II | |
| BSA | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GC305010-100g | |
| C57BL/6J | Cavion Experimental Animal Co., Changzhou, China | license number SCXY (Su) 2011–0003 | |
| Ceruletide | MCE, New Jersey, USA | 17650-98-5 | 50 µg/kg |
| Chemiluminescence imager | Cytiva CO.,LTD.;USA | ||
| Citric acid antigen repair Solution (Dry powder pH 6.0) | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1201-5 L | |
| Collagenase IV | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GC305014 | 0.5 mg/mL |
| DAB (SA-HRP) Tunel Cell Apoptosis Detection Kit | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1507-100 T | |
| Dimension EXL with LM Integrated Chemistry System | Siemens Healthcare Diagnostics Inc.Brookfield,USA | YZB/USA 8311-2014 | |
| ECL developer | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | ||
| Eosin dye (alcohol soluble) | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1001-100 ml | |
| EthoVision XT | Noldus, Netherlands | ||
| FITC-labeled goat anti-rabbit IgG | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GB22303 | diluted at 1:50 |
| Fully automatic blood cell analyzer | Zybio Inc. China | Zybio-Z3 CRP | |
| GapDH | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GB11103 | diluted at 1:1500 |
| Hematoxylin blue return solution | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1040-500 ml | |
| Hematoxylin differentiation solution | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1039-500 ml | |
| Hematoxylin dye | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1004-100 ml | |
| HMGB-1 ELISA kits | njjcbio Co., Ltd, China | ||
| HOMOGENIZER | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | KZ-III-F;IC111150 100222 | |
| HRP-labeled goat anti-rabbit IgG | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GB23303 | diluted at 1:1500 |
| IL-6 ELISA kits | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GEM0001 | |
| Lipase | Mindray,China | ||
| Lipopolysaccharide | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GC205009 | 15 mg/kg |
| Low temperature high speed centrifuge | Changsha Pingfan Apparatus&Instrument Co.,Ltd.,China | TGL-20M | |
| Membrane breaking liquid | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1204 | |
| microtome | Jinhua Craftek Instrument Co., Ltd.;China | CR-601ST | |
| Nylon mesh | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | 200-mesh | |
| One-step TUNEL cell apoptosis detection kit (DAB staining method) | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1507-100T | |
| Paraffin tissue embedding machine | PRECISION MEDICAL INSTRUMENTS CO.,LTD;Changzhou,China | PBM-A | |
| Pathological tissue drying apparatus | PRECISION MEDICAL INSTRUMENTS CO.,LTD;Changzhou,China | PHY-III | |
| Phosphate-buffered saline | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G4202-100ML | |
| PMSF | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G2008-1 ml | |
| Positive fluorescence microscope | Olympus Corporation,Tokyo, Japan | BX53 | |
| Pro Calcitonin | Mindray,China | ||
| PVDF membrane | Millipore, USA | 0.22 µm | |
| RIPA | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G2002-100 ml | |
| SDS-PAGE | Beyotime Biotechnology,China | P0012A | |
| TNF-αELISA kits | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GEM0004 | |
| Ultrasonic water bath | DONGGUAN KQAO ULTRASONIC EQUIPMENT CO.,LTD.;China | KQ-200KDE | |
| Western Blot | Bio-Rad Laboratories, Inc.,USA | ||
| Western blot imaging System | Global Life Sciences IP Holdco LLC, JAPAN | Amersham ImageQuant 800 | |
| Whirlpool mixer | SCILOGEX;USA |
Referencias
- Gliem, N., Ammer-Herrmenau, C., Ellenrieder, V., Neesse, A. Management of severe acute pancreatitis: An update. Digestion. 102 (4), 503-507 (2021).
- Duan, F., et al. GDF11 ameliorates severe acute pancreatitis through modulating macrophage M1 and M2 polarization by targeting the TGFbetaR1/SMAD-2 pathway. Int Immunopharmacol. 108, 108777 (2022).
- Zhang, X. P., et al. Preparation method of an ideal model of multiple organ injury of rat with severe acute pancreatitis. World J Gastroenterol. 13 (34), 4566-4573 (2007).
- Bluth, M. H., Patel, S. A., Dieckgraefe, B. K., Okamoto, H., Zenilman, M. E. Pancreatic regenerating protein (reg I) and reg I receptor mRNA are upregulated in rat pancreas after induction of acute pancreatitis. World J Gastroenterol. 12 (28), 4511-4516 (2006).
- Qiu, F., Lu, X. S., Huang, Y. K. Effect of low molecular weight heparin on pancreatic micro-circulation in severe acute pancreatitis in a rodent model. Chin Med J (Engl). 120 (24), 2260-2263 (2007).
- Lombardi, B., Estes, L. W., Longnecker, D. S. Acute hemorrhagic pancreatitis (massive necrosis) with fat necrosis induced in mice by DL-ethionine fed with a choline-deficient diet. Am J Pathol. 79 (3), 465-480 (1975).
- Liu, Y., et al. Deletion of XIAP reduces the severity of acute pancreatitis via regulation of cell death and nuclear factor-kappaB activity. Cell Death Dis. 8 (3), e2685 (2017).
- Niederau, C., Ferrell, L. D., Grendell, J. H. Caerulein-induced acute necrotizing pancreatitis in mice: Protective effects of proglumide, benzotript, and secretin. Gastroenterology. 88, 1192-1204 (1985).
- Zhou, X., et al. DPP4 inhibitor attenuates severe acute pancreatitis-associated intestinal inflammation via Nrf2 signaling. Oxid Med Cell Longev. 2019, 6181754 (2019).
- Yang, J., et al. Heparin protects severe acute pancreatitis by inhibiting HMGB-1 active secretion from macrophages. Polymers (Basel). 14 (12), 2470 (2022).
- Kong, L., et al. Sitagliptin activates the p62-Keap1-Nrf2 signalling pathway to alleviate oxidative stress and excessive autophagy in severe acute pancreatitis-related acute lung injury. Cell Death Dis. 12 (10), 928 (2021).
- Tan, J. H., et al. ATF6 aggravates acinar cell apoptosis and injury by regulating p53/AIFM2 transcription in severe acute pancreatitis. Theranostics. 10 (18), 8298-8314 (2020).
- Schmidt, J., et al. A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy. Ann Surg. 215 (1), 44-56 (1992).
- Luo, C., et al. Abdominal paracentesis drainage attenuates severe acute pancreatitis by enhancing cell apoptosis via PI3K/AKT signaling pathway. Apoptosis. 25 (3-4), 290-303 (2020).
- Fontaine, D. A., Davis, D. B. Attention to background strain is essential for metabolic research: C57BL/6 and the international knockout mouse consortium. Diabetes. 65 (1), 25-33 (2016).
- Wan, J., et al. Pancreas-specific CHRM3 activation causes pancreatitis in mice. JCI Insight. 6 (17), e132585 (2021).
- Sah, R. P., et al. Cerulein-induced chronic pancreatitis does not require intra-acinar activation of trypsinogen in mice. Gastroenterology. 144 (5), 1076-1085 (2013).
- Wang, K., et al. Activation of AMPK ameliorates acute severe pancreatitis by suppressing pancreatic acinar cell necroptosis in obese mice models. Cell Death Discov. 9 (1), 363 (2023).
- Jin, C., Li, J. C. Establishment of a severe acute pancreatitis model in mice induced by combined Rain Frog Peptide and lipopolysaccharide and exploration of its mechanism. Acta Exp Bio Sinica. 36 (2), 91-96 (2003).
- Tan, J. H., et al. ATF6 aggravates acinar cell apoptosis and injury by regulating p53/AIFM2 transcription in severe acute pancreatitis. Theranostics. 10 (18), 8298-8314 (2020).
- Roy, R. V., et al. Pancreatic Ubap2 deletion regulates glucose tolerance, inflammation, and protection from Caerulein-induced pancreatitis. Cancer Lett. 578, 216455 (2023).
- Chen, R., Kang, R., Tang, D. The mechanism of HMGB1 secretion and release. Exp Mol Med. 54 (2), 91-102 (2022).
- Murao, A., Aziz, M., Wang, H., Brenner, M., Wang, P. Release mechanisms of major DAMPs. Apoptosis. 26 (3-4), 152-162 (2021).
- Liu, T., et al. Accuracy of circulating histones in predicting persistent organ failure and mortality in patients with acute pancreatitis. Br J Surg. 104 (9), 1215-1225 (2017).
- Li, N., Wang, B. M., Cai, S., Liu, P. L. The role of serum high mobility Group Box 1 and Interleukin-6 levels in acute pancreatitis: A meta-analysis. J Cell Biochem. 119 (1), 616-624 (2018).
.