Préparation d’un modèle murin de pancréatite aiguë sévère par une combinaison de céruleine et d’injection intrapéritonéale de lipopolysaccharide
Summary
L’administration intrapéritonéale de médicaments est une approche non invasive sûre et efficace pour induire des lésions pancréatiques. Cette étude a comparé cinq protocoles d’injection intrapéritonéale distincts sur des souris pour induire divers degrés de lésions pancréatiques et a établi un modèle de lésions pancréatiques sévères pour étudier les changements pathologiques et les stratégies de traitement de la pancréatite aiguë sévère (PAS).
Abstract
Le traitement de la pancréatite aiguë sévère (PAS), avec des taux de mortalité élevés, pose un défi clinique important. L’étude des changements pathologiques associés au SAP à l’aide de modèles animaux peut aider à identifier des cibles thérapeutiques potentielles et à explorer de nouvelles approches de traitement. Des études antérieures ont principalement induit des lésions pancréatiques par injection rétrograde de taviaurocholate de sodium dans les voies biliaires, mais l’impact des lésions chirurgicales sur la qualité du modèle animal reste incertain. Dans cette étude, nous avons utilisé différentes fréquences d’injections intrapéritonéales de Cærulein combinées à différentes doses de LPS pour induire des lésions pancréatiques chez les souris C57BL/6J et avons comparé l’étendue des lésions dans cinq protocoles d’injection intrapéritonéale. En ce qui concerne l’induction d’une pancréatite aiguë chez la souris, un protocole d’injection intrapéritonéale est proposé qui entraîne un taux de mortalité pouvant atteindre 80% en 5 jours. Plus précisément, les souris ont reçu dix injections intrapéritonéales quotidiennes de céruleine (50 μg/kg), suivies d’une injection de LPS (15 mg/kg) une heure après la dernière administration de céruleine. En ajustant la fréquence et la posologie des médicaments injectés, on peut manipuler efficacement la gravité des lésions pancréatiques. Ce modèle présente une forte contrôlabilité et a un cycle de réplication court, ce qui permet à un seul chercheur de le réaliser sans nécessiter d’équipement coûteux. Il simule de manière pratique et précise les principales caractéristiques de la maladie observées dans le SAP humain tout en démontrant un haut degré de reproductibilité.
Introduction
La pancréatite aiguë sévère se caractérise par une apparition rapide, une progression rapide et des taux de mortalité élevés dans le domaine1 des maladies du système digestif. Son taux de mortalité élevé a toujours été un objectif majeur de la recherche clinique. En raison de l’évolution imprévisible des conditions cliniques, de l’hétérogénéité des manifestations de la maladie et de la disponibilité limitée d’échantillons humains, l’établissement de modèles animaux est devenu de plus en plus crucial pour la recherche sur les maladies.
L’injection rétrograde de taurocholate de sodium dans le canal cholédoque est couramment utilisée pour créer un modèle de rat de SAP2. En simulant l’obstruction pancréaticobiliaire et en induisant un reflux de la bile et du liquide pancréatique, cette technique de modélisation présente un taux de réussite élevé dans la réplication de modèles animaux SAP. Cependant, il convient de noter que la chirurgie invasive a un impact sur le modèle animal lui-même. De plus, cette méthode est limitée aux animaux plus grands, tels que les rats et les chiens, qui sont principalement utilisés comme sujets d’expérience. D’autres techniques, notamment l’intubation duodénale3, la ponction duodénale directe4 et la ponction directe du canal biliaire-canal pancréatique5, sont fréquemment utilisées à des fins de modélisation.
Les méthodes d’injection intrapéritonéale et de modélisation diététique offrent des avantages non invasifs qui peuvent être appliqués à des animaux de toutes tailles. Le modèle murin de SAP induit par l’alimentation de l’éthionine déficiente en choline (CDE)6 présente certaines complications, telles qu’une hyperglycémie et une hypocalcémie peu contrôlables, ce qui le rend impropre à l’évaluation de nouvelles approches diagnostiques et thérapeutiques. D’autre part, l’injection intrapéritonéale de Caerulein associée à la L-arginine7 représente la méthode la plus couramment utilisée pour induire une pancréatite aiguë chez la souris. Plus précisément, l’administration intrapéritonéale répétée de Caerulein, un analogue de la cholécystokinine, constitue une approche très appropriée pour étudier divers aspects liés à cette maladie destructrice, notamment la pathogenèse, l’inflammation et les processus de régénération. En raison de sa similitude structurelle avec la cholécystokinine (CCK), la céruleine stimule efficacement la contraction de la vésicule biliaire et la sécrétion d’enzymes pancréatiques, entraînant un déséquilibre de la sécrétion d’enzymes suivi d’une autodestruction ultérieure8. Le lipopolysaccharide (LPS), omniprésent et largement étudié en tant que molécule moléculaire associée à un agent pathogène, peut être combiné à la céruleine par injection intrapéritonéale pour établir un modèle de souris efficace de SAP. Cette combinaison déclenche et libère rapidement un nombre important de cytokines inflammatoires, entraînant une inflammation locale et systémique excessive. Plusieurs études ont rapporté l’induction de modèles SAP chez la souris par injection intrapéritonéale de Caerulein combinée à du LPS. Cela peut être attribué au fait que l’injection intrapéritonéale de Caerulein peut provoquer un œdème pancréatique et une hémorragie chez la souris, tandis que l’ajout de LPS peut induire immédiatement une nécrose pancréatique et exacerber la réponse inflammatoire systémique, la septicémie et même la défaillance d’organe. À l’heure actuelle, il existe des variations dans la posologie et la fréquence des injections intrapéritonéales de céruleine, ainsi qu’une incohérence dans la posologie supplémentaire de LPS. Assurer la cohérence des modèles SAP de souris est un défi 9,10,11,12 ; Par conséquent, il est nécessaire d’établir un protocole standardisé pour obtenir un modèle idéal. Dans cet article, nous décrivons un protocole d’injection intrapéritonéale chez la souris et étudions la fréquence d’injection optimale et la dose supplémentaire de LPS.
Protocol
Representative Results
Discussion
À l’heure actuelle, il n’existe pas de moyens efficaces d’améliorer le taux de mortalité élevé chez les patients atteints de pancréatite aiguë sévère. Il est crucial d’étudier l’efficacité des médicaments dans l’amélioration des mécanismes de stabilité immunitaire. Il existe un besoin urgent d’un modèle animal idéal pour la pancréatite aiguë sévère. Les souris avec un patrimoine génétique C57BL/6J sont largement utilisées dans la recherche biomédicale, y compris les études sur la p…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée par des projets de recherche en sciences de la santé et en sciences médicales dans la ville de Huainan (No. HNWJ2023005) ; Programme municipal d’orientation scientifique et technologique dans la ville de Huainan (n° 2023151) ; Programme de formation à l’innovation et à l’entrepreneuriat pour les étudiants des collèges provinciaux de l’Anhui (n° S202310361254) ; La neuvième promotion de la série « 50· Étoiles de la science et de la technologie » dans la ville de Huainan et le projet de construction d’une spécialité clinique clé dans la province de l’Anhui. Nous tenons à exprimer notre gratitude au département de laboratoire du premier hôpital affilié de l’Université des sciences et technologies d’Anhui pour avoir fourni les données de test pertinentes.
Materials
| 20× Citric Acid Antigen Repair Solution (pH 6.0) | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1202-250 ml | |
| Amylase | Mindray,China | ||
| Annexin V-FITC/PI | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1511 | diluted at 1:20 |
| Anti-HMGB1 Rabbit pAB | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GB11103 | diluted at 1:1800 |
| BCA protein quantitative detection kit | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G2026-200T | |
| BD FACSCanto II Flow Cytometer | BD Life Sciences, San Jose, CA, 95131, USA | BD FACSCanto II | |
| BSA | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GC305010-100g | |
| C57BL/6J | Cavion Experimental Animal Co., Changzhou, China | license number SCXY (Su) 2011–0003 | |
| Ceruletide | MCE, New Jersey, USA | 17650-98-5 | 50 µg/kg |
| Chemiluminescence imager | Cytiva CO.,LTD.;USA | ||
| Citric acid antigen repair Solution (Dry powder pH 6.0) | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1201-5 L | |
| Collagenase IV | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GC305014 | 0.5 mg/mL |
| DAB (SA-HRP) Tunel Cell Apoptosis Detection Kit | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1507-100 T | |
| Dimension EXL with LM Integrated Chemistry System | Siemens Healthcare Diagnostics Inc.Brookfield,USA | YZB/USA 8311-2014 | |
| ECL developer | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | ||
| Eosin dye (alcohol soluble) | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1001-100 ml | |
| EthoVision XT | Noldus, Netherlands | ||
| FITC-labeled goat anti-rabbit IgG | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GB22303 | diluted at 1:50 |
| Fully automatic blood cell analyzer | Zybio Inc. China | Zybio-Z3 CRP | |
| GapDH | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GB11103 | diluted at 1:1500 |
| Hematoxylin blue return solution | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1040-500 ml | |
| Hematoxylin differentiation solution | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1039-500 ml | |
| Hematoxylin dye | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1004-100 ml | |
| HMGB-1 ELISA kits | njjcbio Co., Ltd, China | ||
| HOMOGENIZER | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | KZ-III-F;IC111150 100222 | |
| HRP-labeled goat anti-rabbit IgG | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GB23303 | diluted at 1:1500 |
| IL-6 ELISA kits | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GEM0001 | |
| Lipase | Mindray,China | ||
| Lipopolysaccharide | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GC205009 | 15 mg/kg |
| Low temperature high speed centrifuge | Changsha Pingfan Apparatus&Instrument Co.,Ltd.,China | TGL-20M | |
| Membrane breaking liquid | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1204 | |
| microtome | Jinhua Craftek Instrument Co., Ltd.;China | CR-601ST | |
| Nylon mesh | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | 200-mesh | |
| One-step TUNEL cell apoptosis detection kit (DAB staining method) | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1507-100T | |
| Paraffin tissue embedding machine | PRECISION MEDICAL INSTRUMENTS CO.,LTD;Changzhou,China | PBM-A | |
| Pathological tissue drying apparatus | PRECISION MEDICAL INSTRUMENTS CO.,LTD;Changzhou,China | PHY-III | |
| Phosphate-buffered saline | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G4202-100ML | |
| PMSF | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G2008-1 ml | |
| Positive fluorescence microscope | Olympus Corporation,Tokyo, Japan | BX53 | |
| Pro Calcitonin | Mindray,China | ||
| PVDF membrane | Millipore, USA | 0.22 µm | |
| RIPA | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G2002-100 ml | |
| SDS-PAGE | Beyotime Biotechnology,China | P0012A | |
| TNF-αELISA kits | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GEM0004 | |
| Ultrasonic water bath | DONGGUAN KQAO ULTRASONIC EQUIPMENT CO.,LTD.;China | KQ-200KDE | |
| Western Blot | Bio-Rad Laboratories, Inc.,USA | ||
| Western blot imaging System | Global Life Sciences IP Holdco LLC, JAPAN | Amersham ImageQuant 800 | |
| Whirlpool mixer | SCILOGEX;USA |
Referencias
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