Drosophila larvalarında nöromüsküler kavşakların transmisyon elektron mikroskobu için numune hazırlama sürecinin optimize edilmesi
Summary
Bu rapor, Drosophila Larvalarında nöromüsküler kavşakları görselleştirmek için yeni bir numune hazırlama prosedürü sunmaktadır. Bu yöntem, geleneksel yönteme kıyasla örneklerin kıvrılmasını önlemede daha etkilidir ve özellikle Drosophila nöromüsküler kavşak ultrastrüktürel analizi için yararlıdır.
Abstract
Drosophila nöromüsküler kavşak (NMJ), sinirbilim alanında değerli bir model sistem olarak ortaya çıkmıştır. Drosophila NMJ’de konfokal mikroskopi uygulaması, araştırmacıların hem sinaps bolluğu hakkındaki nicel verileri hem de morfolojilerine ilişkin ayrıntılı bilgileri kapsayan sinaptik bilgi edinmelerini sağlar. Bununla birlikte, TEM’in dağınık dağılımı ve sınırlı görsel aralığı, ultrastrüktürel analiz için zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Bu çalışma, geleneksel yaklaşımı aşan yenilikçi ve verimli bir numune hazırlama yöntemini tanıtmaktadır. Prosedür, düz tabanlı bir şişenin veya test tüpünün tabanına metal bir ağ yerleştirilerek başlar, ardından sabit larva örneklerini ağ üzerine yerleştirir. Numunelerin üzerine ek bir ağ yerleştirilir ve iki ağ arasına yerleştirilmelerini sağlar. Sabitlenen numuneler, gömme prosedürüne devam etmeden önce iyice kurutulur ve sızar. Daha sonra numunelerin epoksi reçineye gömülmesi, konumlandırma ve kesitleme için kasların hazırlanmasına izin veren düz bir tabaka şeklinde gerçekleştirilir. Bu adımlardan yararlanarak, Drosophila larvalarının tüm kasları ışık mikroskobu altında görselleştirilebilir, böylece sonraki konumlandırma ve kesitleme işlemleri kolaylaştırılır. Fazla reçine, A2 ve A 3 vücut segmentlerinin 6. ve 7. kasları yerleştirildikten sonra çıkarılır. 6. veya 7. kasın seri ultra ince kesiti yapılır.
Introduction
Elektron mikroskobu, nano ölçekli seviye1’de hücrelerin iç yapısını görsel ve doğru bir şekilde gösterebilen biyolojik malzemelerin üst yapısını incelemek için en ideal yöntemlerden biridir. Bununla birlikte, numune hazırlama işleminin karmaşıklığı ve yüksek maliyeti nedeniyle, elektron mikroskobu ışık mikroskobu kadar popüler değildir. Elektron mikroskobu tekniklerindeki son gelişmeler, görüntü kalitesinde önemli gelişmelere yol açmış ve ilgili iş yükünde kayda değer bir azalmaya yol açmıştır. Sonuç olarak, elektron mikroskobu çeşitli alanlarda bilimsel bilginin ilerlemesinde önemli bir rol üstlenmiştir2.
Drosophila, hedef genlerin uzamsal ve zamansal ifadesini hassas bir şekilde kontrol etmek için genetik manipülasyonlar yapmak için mükemmel bir hayvan modelidir3. Ayrıca Drosophila, memeli modellerine göre kısa büyüme periyodu ve kolay yetiştirme avantajlarına sahiptir; bu nedenle, Drosophila morfoloji araştırmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır 4,5.
Drosophila larvalarında, nöromüsküler kavşak (NMJ) butonları kaslardayaygın olarak dağılmıştır 6,7 ve NMJ’nin immün boyanması, sinaps miktarı ve morfolojisi 8,9 hakkında kolayca bilgi sağlayabilir. A2 ve A3 segmentlerinin6 / 7 inci kaslarında bulunan NMJ boutonları, ışık mikroskobu kullanılarak yapılan kantitatif ve morfolojik araştırmalar için çok uygundur. Bunun nedeni büyüklükleri ve bolluklarıdır10,11. Bu nedenle, Drosophila larvaları NMJ’leri sinirbilim araştırmaları için yararlı bir model olarak kabul edilir12.
Bununla birlikte, TEM tarafından NMJ bouton üst yapısını gözlemlemek zordur. Transmisyon elektron mikroskobunun tarama penceresi dar olduğundan, yaygın olarak dağıtılan NMJ boutonları13’ü konumlandırmak zordur. Diğer bir neden ise, Drosophila vücut duvarının, numune hazırlama protokolü7’nin alkol dehidrasyon adımı sırasında kıvrılmaya duyarlı olmasıdır.
Geleneksel çalışmalar, bollukları ve büyüklükleri nedeniyle genellikle A,2 ve A 3 segmentlerinin 6. ve 7. kasları arasındaki boutonları örnek materyal olarak seçmiştir14,15. A, 2 ve A3 segmentlerinin 6. ve 7. kasları diğer kaslardan daha büyüktür ve daha fazla bouton içerir. Bununla birlikte, elektron mikroskobu için numuneler hazırlandığında, sabit numuneler incelme ve kıvrılmaya eğilimli olma eğilimindeydi, bu da A2 ve A 3 segmentlerinin 6. ve 7. kaslarının yanlış konumlandırılmasına yol açtı.
Bu vesileyle, geleneksel numune hazırlama yöntemine 7,16 kıyasla numunelerin kıvrılmasını önlemede daha etkili olan, numunelerin müteakip dehidrasyon sırasında düz kalmasına izin veren ve böylece Drosophila larva nöromüsküler kavşaklarının daha iyi konumlandırılmasını kolaylaştıran yeni bir işleme prosedürünü rapor ediyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Drosophila larva örnekleri, örnekler ince olduğu için dehidrasyon sırasında kıvrılma eğilimindedir, bu da nöromüsküler kavşağın doğru bir şekilde bulunmasını zorlaştırır, böylece örnek hazırlama için zorluğu ve iş yükünü artırır. Geleneksel iyileştirme, numune7’yi kısaltmaktır, ancak numuneler hala farklı derecelerde kıvrılmıştır.
Yöntemimizde iki kritik adım vardır: birincisi, metal ağların kısıtlanması nedeniy…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Çin Doğa Bilimleri Vakfı Hibe 32070811 ve Güneydoğu Üniversitesi (Çin) Analiz Test Fonu 11240090971 tarafından desteklenmiştir. Elektron Mikroskobu Laboratuvarı ve Morfolojik Analiz Merkezi, Tıp Fakültesi, Güneydoğu Üniversitesi, Nanjing, Çin’e teşekkür ederiz.
Materials
| 1,2-Epoxypropane | SHANGHAI LING FENG CHEMICAL REAGENT CO., LTD | JYJ 037-2015 | Penetrating Agent |
| Drosophila Stocks | Bloomington | none | The wild-type control Drosophila strains used in this research were all W1118, and were reared according to standard culture methods |
| Flat-bottomed glass test tubes | Haimen Chenxing Experimental equipment Company | none | Flat-bottomed glass test tubes(bottle)with sponge plug(or bottle stopper) |
| K4M cross-linker | Agar Scientific | Cat# 1924B | The embedding resins are based on a highly cross-linked acrylate and methacrylate formula |
| K4M resin (monomer B) | Agar Scientific | Lot# 631557 | Resin Monomer |
| Polyvinyl film | Haimen Chenxing Experimental equipment Company | none | Transparent polyethylene film is the best , thickness of about 0.2mm |
| SPI Chem DDSA | SPI | SpI#02827-AF | Dodecenyl Succinic Anhydride |
| SPI-Chem DMP-30 Epoxy | SPI | 02823-DA | Accelerator |
| SPI-Chem NMA | SPI | SpI#02828-AF | Hardner for Epoxy |
| SPI-PON 812 Epoxy | SPI | SPI#0259-AB | Resin Monomer |
| Steel mesh | Yuhuiyuan Gardening Store(online) | none | Copper or stainless steel net |
| Transmission electron microscopy | Hitachi H-7650 | 11416692 | All grids (on which samples were gathered) were stained with lead citrate and observed under a transmission electron microscopy. |
| Ultrathin microtome | Leica UC7 ultrathin microtome | 595915 | All sectioning operations are carried out on a Leica UC7 ultrathin microtome using a diamond knife |
Referencias
- Acevedo, N. C., Marangoni, A. G. Nanostructured fat crystal systems. Annual Review of Food Science and Technology. 6, 71-96 (2015).
- Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
- Winans, N. J., et al. A genomic investigation of ecological differentiation between free-living and Drosophila-associated bacteria. Molecular Ecology. 26 (17), 4536-4550 (2017).
- Phelps, J. S., et al. Reconstruction of motor control circuits in adult Drosophila using automated transmission electron microscopy. Cell. 184 (3), 759-774 (2021).
- Cardona, A., et al. An integrated micro- and macroarchitectural analysis of the Drosophila brain by computer-assisted serial section electron microscopy. PLoS Biology. 8 (10), (2010).
- Belalcazar, H. M., Hendricks, E. L., Zamurrad, S., Liebl, F. L. W., Secombe, J. The histone demethylase KDM5 is required for synaptic structure and function at the Drosophila neuromuscular junction. Cell Reports. 34 (7), 108753 (2021).
- Banerjee, S., Venkatesan, A., Bhat, M. A. Neurexin, neuroligin and wishful thinking coordinate synaptic cytoarchitecture and growth at neuromuscular junctions. Molecular Cell and Neurosciences. 78, 9-24 (2017).
- Guangming, G., Junhua, G., Chenchen, Z., Yang, M., Wei, X. Neurexin and neuroligins maintain the balance of ghost and satellite boutons at the Drosophila neuromuscular junction. Frontiers in Neuroanatomy. 14, 19 (2020).
- Jia, X. X., Gorczyca, M., Budnik, V. Ultrastructure of neuromuscular junctions in Drosophila: comparison of wild type and mutants with increased excitability. Journal of Neurobiology. 24 (8), 1025-1044 (1993).
- Ashley, J., et al. Retrovirus-like gag protein Arc1 binds RNA and traffics across synaptic boutons. Cell. 172 (1-2), 262-274 (2018).
- Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. Dynactin is necessary for synapse stabilization. Neuron. 34 (5), 729-741 (2002).
- Featherstone, D. E., Rushton, E., Broadie, K. Developmental regulation of glutamate receptor field size by nonvesicular glutamate release. Nature Neurosciences. 5 (2), 141-146 (2002).
- Wagner, N., Laugks, U., Heckmann, M., Asan, E., Neuser, K. Aging Drosophila melanogaster display altered pre- and postsynaptic ultrastructure at adult neuromuscular junctions. Journal of Comparative Neurology. 523 (16), 2457-2475 (2015).
- Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae. Journal of Neurobiology. 24 (8), 1008-1024 (1993).
- McCabe, B. D., et al. The BMP homolog Gbb provides a retrograde signal that regulates synaptic growth at the Drosophila neuromuscular junction. Neuron. 39 (2), 241-254 (2003).
- Guangming, G., Mei, C., Chenchen, Z., Wei, X., Junhua, G. Improved analysis method of neuromuscular junction in Drosophila. larvae by transmission electron microscopy. Anatomical Science International. 97 (1), 147-154 (2022).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. Journal of Visualized Experiments. (24), e1107 (2009).
- Lovrić, J., et al. Multimodal imaging of chemically fixed cells in preparation for NanoSIMS. Analytical Chemistry. 88 (17), 8841-8848 (2016).
- Woods, P. S., Ledbetter, M. C. Cell organelles at uncoated cryofractured surfaces as viewed with the scanning electron microscope. Journal of Cell Sciences. 21 (1), 47-58 (1976).
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. Journal of Physiology. 262 (1), 189-214 (1976).
- Prokop, A. Organization of the efferent system and structure of neuromuscular junctions in Drosophila. International Review in Neurobiology. 75, 71-90 (2006).
- Lloyd, T. E., et al. The p150(Glued) CAP-Gly domain regulates initiation of retrograde transport at synaptic termini. Neuron. 74 (2), 344-360 (2012).
- Budnik, V., Zhong, Y., Wu, C. F. Morphological plasticity of motor axons in Drosophila mutants with altered excitability. Journal of Neuroscience. 10 (11), 3754-3768 (1990).
- Zhang, X., et al. Neuroligin 4 regulates synaptic growth via the bone morphogenetic protein (BMP) signaling pathway at the Drosophila neuromuscular junction. Journal of Biological Chemistry. 292 (44), 17991-18005 (2017).
- Wu, S., et al. A pre-synaptic function of shank protein in Drosophila. Journal of Neuroscience. 37 (48), 11592-11604 (2017).
- Gan, G., Lv, H., Xie, W. Morphological identification and development of neurite in Drosophila ventral nerve cord neuropil. PLoS One. 9 (8), 105497 (2014).
