Optimización del proceso de preparación de muestras para la microscopía electrónica de transmisión de uniones neuromusculares en larvas de Drosophila
Summary
Este informe proporciona un nuevo procedimiento de preparación de muestras para visualizar las uniones neuromusculares en larvas de Drosophila . Este método es más eficaz para evitar el enroscamiento de las muestras en comparación con el método tradicional y es particularmente útil para el análisis ultraestructural de la unión neuromuscular de Drosophila .
Abstract
La unión neuromuscular de Drosophila (NMJ) se ha convertido en un valioso sistema modelo en el campo de la neurociencia. La aplicación de la microscopía confocal en el NMJ de Drosophila permite a los investigadores adquirir información sináptica, que abarca tanto datos cuantitativos sobre la abundancia de sinapsis como información detallada sobre su morfología. Sin embargo, la distribución difusa y el alcance visual limitado del TEM presentan desafíos para el análisis ultraestructural. Este estudio presenta un método innovador y eficiente de preparación de muestras que supera el enfoque convencional. El procedimiento comienza colocando una malla metálica en la base de una botella de fondo plano o tubo de ensayo, seguido de la colocación de muestras de larvas fijas en la malla. Se coloca una malla adicional sobre las muestras, asegurando que estén colocadas entre las dos mallas. Las muestras fijas se deshidratan completamente y se infiltran antes de continuar con el procedimiento de incrustación. Luego, la incrustación de las muestras en resina epoxi se realiza en forma de lámina plana, lo que permite la preparación de los músculos para el posicionamiento y la sección. Beneficiándose de estos pasos, todos los músculos de las larvas de Drosophila pueden visualizarse bajo microscopía óptica, lo que facilita su posterior posicionamiento y seccionamiento. El exceso de resina se elimina después de localizar los músculos6º y7º de los segmentos corporalesA2 yA3. Se realiza un corte ultrafino en serie del6º o7º músculo.
Introduction
La microscopía electrónica es uno de los métodos más idóneos para estudiar la ultraestructura de materiales biológicos que puede demostrar de forma visual y precisa la estructura interna de las células a nivel nanométrico1. Sin embargo, debido a la complejidad del proceso de preparación de muestras y al alto costo, la microscopía electrónica no es tan popular como la microscopía óptica. Los avances recientes en las técnicas de microscopía electrónica han dado lugar a mejoras significativas en la calidad de las imágenes, coincidiendo con una notable reducción de la carga de trabajo asociada. En consecuencia, la microscopía electrónica ha asumido un papel importante en el avance del conocimiento científico en diversos campos2.
Drosophila es un excelente modelo animal para realizar manipulaciones genéticas con el fin de controlar con precisión la expresión espacial y temporal de los genes diana3. Además, Drosophila tiene las ventajas de un período de crecimiento corto y una crianza fácil en comparación con los modelos de mamíferos; por lo tanto, Drosophila es ampliamente utilizada en la investigación de morfología 4,5.
En las larvas de Drosophila, los botones de la unión neuromuscular (NMJ) están ampliamente distribuidos en los músculos 6,7, y la inmunotinción de NMJ puede proporcionar fácilmente información sobre la cantidad y morfología de la sinapsis 8,9 . Los botones NMJ ubicados en los músculos6º/7º de los segmentos A2 y A3 son muy adecuados para la investigación cuantitativa y morfológica mediante microscopía óptica. Esto se debe a su tamaño y abundancia10,11. Por lo tanto, las larvas de Drosophila NMJs se consideran un modelo útil para la investigación en neurociencia12.
Sin embargo, es un desafío observar la ultraestructura del bautista NMJ por el TEM. Dado que la ventana de barrido de la microscopía electrónica de transmisión es estrecha, es difícil posicionar los botones NMJ13 ampliamente distribuidos. La otra razón es que la pared corporal de Drosophila es susceptible de enroscarse durante la etapa de deshidratación alcohólica del protocolo de preparación de muestras7.
Los estudios tradicionales han escogido generalmente botones entre los músculos6º y7º de los segmentosA2 yA3 como material de muestra debido a su abundancia y tamaño14,15. Los músculos6º y7º de los segmentosA2 yA3 son más grandes que los otros músculos y contienen más botones. Sin embargo, cuando las muestras se prepararon para microscopía electrónica, las muestras fijas tendían a volverse delgadas y propensas a curvarse, lo que conducía a un posicionamiento incorrecto de los músculos6º y7º de los segmentos A2 y A3.
Presentamos un nuevo procedimiento de procesamiento que es más efectivo para prevenir el enroscamiento de las muestras en comparación con el método tradicional de preparación de muestras 7,16, al permitir que las muestras permanezcan planas durante la deshidratación posterior, lo que facilita un mejor posicionamiento de las uniones neuromusculares de las larvas de Drosophila.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las muestras de larvas de Drosophila tienden a enroscarse durante la deshidratación, ya que las muestras son delgadas, lo que dificulta la localización precisa de la unión neuromuscular, lo que aumenta la dificultad y la carga de trabajo para la preparación de la muestra. La mejora tradicional consiste en acortar la muestra7, pero las muestras seguían estando curvadas en diferentes grados.
En nuestro método, hay dos pasos críticos: primero, las muestras …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Ciencias Naturales de China Grant 32070811 y el Fondo de Pruebas de Análisis de la Universidad del Sureste (China) 11240090971. Agradecemos al Laboratorio de Microscopía Electrónica y Centro de Análisis Morfológico de la Facultad de Medicina de la Universidad del Sureste, Nanjing, China.
Materials
| 1,2-Epoxypropane | SHANGHAI LING FENG CHEMICAL REAGENT CO., LTD | JYJ 037-2015 | Penetrating Agent |
| Drosophila Stocks | Bloomington | none | The wild-type control Drosophila strains used in this research were all W1118, and were reared according to standard culture methods |
| Flat-bottomed glass test tubes | Haimen Chenxing Experimental equipment Company | none | Flat-bottomed glass test tubes(bottle)with sponge plug(or bottle stopper) |
| K4M cross-linker | Agar Scientific | Cat# 1924B | The embedding resins are based on a highly cross-linked acrylate and methacrylate formula |
| K4M resin (monomer B) | Agar Scientific | Lot# 631557 | Resin Monomer |
| Polyvinyl film | Haimen Chenxing Experimental equipment Company | none | Transparent polyethylene film is the best , thickness of about 0.2mm |
| SPI Chem DDSA | SPI | SpI#02827-AF | Dodecenyl Succinic Anhydride |
| SPI-Chem DMP-30 Epoxy | SPI | 02823-DA | Accelerator |
| SPI-Chem NMA | SPI | SpI#02828-AF | Hardner for Epoxy |
| SPI-PON 812 Epoxy | SPI | SPI#0259-AB | Resin Monomer |
| Steel mesh | Yuhuiyuan Gardening Store(online) | none | Copper or stainless steel net |
| Transmission electron microscopy | Hitachi H-7650 | 11416692 | All grids (on which samples were gathered) were stained with lead citrate and observed under a transmission electron microscopy. |
| Ultrathin microtome | Leica UC7 ultrathin microtome | 595915 | All sectioning operations are carried out on a Leica UC7 ultrathin microtome using a diamond knife |
Referencias
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