אופטימיזציה של תהליך הכנת הדגימה להעברת מיקרוסקופ אלקטרונים של צמתים עצביים-שריריים בזחלי דרוזופילה
Summary
דוח זה מספק הליך הכנת מדגם חדש להדמיית צמתים עצביים-שריריים בזחלי דרוזופילה . שיטה זו יעילה יותר במניעת סלסול הדגימות בהשוואה לשיטה המסורתית והיא שימושית במיוחד עבור Drosophila neuromuscular junction ultrastructural analysis.
Abstract
הצומת הנוירומוסקולרית דרוזופילה (NMJ) התפתחה כמערכת מודל רבת ערך בתחום מדעי המוח. היישום של מיקרוסקופ קונפוקלי ב – Drosophila NMJ מאפשר לחוקרים להשיג מידע סינפטי, המקיף הן נתונים כמותיים על שפע סינפסות והן תובנות מפורטות לגבי המורפולוגיה שלהם. עם זאת, ההתפלגות המפוזרת והטווח החזותי המוגבל של ה- TEM מציבים אתגרים לניתוח האולטרה-סטרוקטורלי. מחקר זה מציג שיטת הכנת דגימות חדשנית ויעילה העולה על הגישה הקונבנציונלית. ההליך מתחיל בהנחת רשת מתכת בבסיס בקבוק או מבחנה בעלת תחתית שטוחה, ולאחר מכן מיקום דגימות זחלים קבועות על הרשת. רשת שינוי נוספת מונחת מעל הדגימות, כדי להבטיח שהן ממוקמות בין שתי רשתות השינוי. הדגימות הקבועות מיובשות היטב ומוחדרות לפני שממשיכים בהליך ההטבעה. לאחר מכן הטבעה של הדגימות בשרף אפוקסי מתבצעת באופן יריעה שטוחה, המאפשרת הכנת שרירים למיקום וחתך. כתוצאה מצעדים אלה, ניתן לדמיין את כל השרירים של זחלי דרוזופילה תחת מיקרוסקופ אור, ובכך להקל על המיקום והחתך הבאים. עודף שרף מוסר לאחר איתור השרירים ה– 6 וה– 7 של חלקי הגוף A2 ו- A3. מבוצעת חתך טורי דק במיוחד של השריר ה– 6 או ה– 7.
Introduction
מיקרוסקופ אלקטרונים הוא אחת השיטות האידיאליות ביותר לחקר מבנה העל של חומרים ביולוגיים שיכולים להדגים חזותית ומדויקת את המבנה הפנימי של תאים ברמה ננומטרית1. עם זאת, בשל מורכבות תהליך הכנת הדגימה והעלות הגבוהה, מיקרוסקופ אלקטרונים אינו פופולרי כמו מיקרוסקופ אור. ההתקדמות האחרונה בטכניקות מיקרוסקופיית אלקטרונים הובילה לשיפור משמעותי באיכות התמונה, במקביל להפחתה יוצאת דופן בעומס העבודה הנלווה. כתוצאה מכך, מיקרוסקופ אלקטרונים תפס תפקיד חשוב בקידום הידע המדעי בתחומים מגוונים2.
דרוזופילה הוא מודל חייתי מצוין לביצוע מניפולציות גנטיות כדי לשלוט במדויק בביטוי המרחבי והזמני של גני מטרה3. חוץ מזה, לדרוזופילה יש את היתרונות של תקופת גדילה קצרה וגידול קל בהשוואה למודלים של יונקים; לכן, דרוזופילה נמצאת בשימוש נרחב במחקר מורפולוגיה 4,5.
בזחלי דרוזופילה, בוטוני צומת נוירומוסקולרי (NMJ) מופצים באופן נרחב בשרירים 6,7, ו immunostaining של NMJ יכול בקלות לספק מידע על כמות סינפסה ומורפולוגיה 8,9 . בוטי NMJ הממוקמיםבשרירים 6/7 של מקטעי A2 ו- A3 מתאימים היטב למחקר כמותי ומורפולוגי באמצעות מיקרוסקופ אור. הסיבה לכך היא גודלם ושפע10,11. לכן, זחלי דרוזופילה NMJ נחשבים מודל שימושי למחקר מדעי המוח12.
עם זאת, זה מאתגר לצפות NMJ bouton ultrastructure על ידי TEM. מכיוון שחלון הסריקה של מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת צר, קשה למקם את הבוטונים NMJ המפוזרים באופן נרחב13. הסיבה השנייה היא שדופן הגוף של דרוזופילה רגישה לסלסול במהלך שלב התייבשות האלכוהול של פרוטוקול הכנת הדגימה7.
מחקרים מסורתיים בדרך כלל בחרו בשרירים בין השרירים ה–6 וה–7 של קטעי A2 ו- A3 כחומרים לדוגמה בגלל השפע והגודל שלהם14,15. השריריםה-6 וה-7 במקטעי A2 ו-A 3 גדולים יותר מהשרירים האחרים ומכילים יותר בוטונים. עם זאת, כאשר הדגימות הוכנו למיקרוסקופ אלקטרונים, דגימות קבועות נטו להיות דקות ונוטות לסלסל, מה שהוביל למיקום לא נכון של השריריםה –6 וה–7 של קטעי A2 ו- A3.
אנו מדווחים בזאת על הליך עיבוד חדש היעיל יותר במניעת סלסול הדגימות בהשוואה לשיטה המסורתית של הכנת הדגימות 7,16, בכך שהוא מאפשר לדגימות להישאר שטוחות במהלך ההתייבשות שלאחר מכן, ובכך להקל על מיקום טוב יותר של הצמתים העצביים-שריריים של זחל דרוזופילה.
Protocol
Representative Results
Discussion
דגימות זחלי דרוזופילה נוטות להתכרבל במהלך התייבשות, מכיוון שהדגימות דקות, מה שמקשה על איתור מדויק של הצומת העצבית-שרירית, ובכך מגדיל את הקושי ועומס העבודה להכנת הדגימה. השיפור המסורתי הוא קיצור מדגם7, אך הדגימות עדיין היו מסולסלות בדרגות שונות.
בשיטה שלנו ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן למדעי הטבע של סין מענק 32070811, ו אוניברסיטת דרום מזרח (סין) ניתוח מבחן קרן 11240090971. אנו מודים למעבדה למיקרוסקופיית אלקטרונים ולמרכז לניתוח מורפולוגי, בית הספר לרפואה, אוניברסיטת דרום-מזרח, נאנג’ינג, סין.
Materials
| 1,2-Epoxypropane | SHANGHAI LING FENG CHEMICAL REAGENT CO., LTD | JYJ 037-2015 | Penetrating Agent |
| Drosophila Stocks | Bloomington | none | The wild-type control Drosophila strains used in this research were all W1118, and were reared according to standard culture methods |
| Flat-bottomed glass test tubes | Haimen Chenxing Experimental equipment Company | none | Flat-bottomed glass test tubes(bottle)with sponge plug(or bottle stopper) |
| K4M cross-linker | Agar Scientific | Cat# 1924B | The embedding resins are based on a highly cross-linked acrylate and methacrylate formula |
| K4M resin (monomer B) | Agar Scientific | Lot# 631557 | Resin Monomer |
| Polyvinyl film | Haimen Chenxing Experimental equipment Company | none | Transparent polyethylene film is the best , thickness of about 0.2mm |
| SPI Chem DDSA | SPI | SpI#02827-AF | Dodecenyl Succinic Anhydride |
| SPI-Chem DMP-30 Epoxy | SPI | 02823-DA | Accelerator |
| SPI-Chem NMA | SPI | SpI#02828-AF | Hardner for Epoxy |
| SPI-PON 812 Epoxy | SPI | SPI#0259-AB | Resin Monomer |
| Steel mesh | Yuhuiyuan Gardening Store(online) | none | Copper or stainless steel net |
| Transmission electron microscopy | Hitachi H-7650 | 11416692 | All grids (on which samples were gathered) were stained with lead citrate and observed under a transmission electron microscopy. |
| Ultrathin microtome | Leica UC7 ultrathin microtome | 595915 | All sectioning operations are carried out on a Leica UC7 ultrathin microtome using a diamond knife |
Referencias
- Acevedo, N. C., Marangoni, A. G. Nanostructured fat crystal systems. Annual Review of Food Science and Technology. 6, 71-96 (2015).
- Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
- Winans, N. J., et al. A genomic investigation of ecological differentiation between free-living and Drosophila-associated bacteria. Molecular Ecology. 26 (17), 4536-4550 (2017).
- Phelps, J. S., et al. Reconstruction of motor control circuits in adult Drosophila using automated transmission electron microscopy. Cell. 184 (3), 759-774 (2021).
- Cardona, A., et al. An integrated micro- and macroarchitectural analysis of the Drosophila brain by computer-assisted serial section electron microscopy. PLoS Biology. 8 (10), (2010).
- Belalcazar, H. M., Hendricks, E. L., Zamurrad, S., Liebl, F. L. W., Secombe, J. The histone demethylase KDM5 is required for synaptic structure and function at the Drosophila neuromuscular junction. Cell Reports. 34 (7), 108753 (2021).
- Banerjee, S., Venkatesan, A., Bhat, M. A. Neurexin, neuroligin and wishful thinking coordinate synaptic cytoarchitecture and growth at neuromuscular junctions. Molecular Cell and Neurosciences. 78, 9-24 (2017).
- Guangming, G., Junhua, G., Chenchen, Z., Yang, M., Wei, X. Neurexin and neuroligins maintain the balance of ghost and satellite boutons at the Drosophila neuromuscular junction. Frontiers in Neuroanatomy. 14, 19 (2020).
- Jia, X. X., Gorczyca, M., Budnik, V. Ultrastructure of neuromuscular junctions in Drosophila: comparison of wild type and mutants with increased excitability. Journal of Neurobiology. 24 (8), 1025-1044 (1993).
- Ashley, J., et al. Retrovirus-like gag protein Arc1 binds RNA and traffics across synaptic boutons. Cell. 172 (1-2), 262-274 (2018).
- Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. Dynactin is necessary for synapse stabilization. Neuron. 34 (5), 729-741 (2002).
- Featherstone, D. E., Rushton, E., Broadie, K. Developmental regulation of glutamate receptor field size by nonvesicular glutamate release. Nature Neurosciences. 5 (2), 141-146 (2002).
- Wagner, N., Laugks, U., Heckmann, M., Asan, E., Neuser, K. Aging Drosophila melanogaster display altered pre- and postsynaptic ultrastructure at adult neuromuscular junctions. Journal of Comparative Neurology. 523 (16), 2457-2475 (2015).
- Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae. Journal of Neurobiology. 24 (8), 1008-1024 (1993).
- McCabe, B. D., et al. The BMP homolog Gbb provides a retrograde signal that regulates synaptic growth at the Drosophila neuromuscular junction. Neuron. 39 (2), 241-254 (2003).
- Guangming, G., Mei, C., Chenchen, Z., Wei, X., Junhua, G. Improved analysis method of neuromuscular junction in Drosophila. larvae by transmission electron microscopy. Anatomical Science International. 97 (1), 147-154 (2022).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. Journal of Visualized Experiments. (24), e1107 (2009).
- Lovrić, J., et al. Multimodal imaging of chemically fixed cells in preparation for NanoSIMS. Analytical Chemistry. 88 (17), 8841-8848 (2016).
- Woods, P. S., Ledbetter, M. C. Cell organelles at uncoated cryofractured surfaces as viewed with the scanning electron microscope. Journal of Cell Sciences. 21 (1), 47-58 (1976).
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. Journal of Physiology. 262 (1), 189-214 (1976).
- Prokop, A. Organization of the efferent system and structure of neuromuscular junctions in Drosophila. International Review in Neurobiology. 75, 71-90 (2006).
- Lloyd, T. E., et al. The p150(Glued) CAP-Gly domain regulates initiation of retrograde transport at synaptic termini. Neuron. 74 (2), 344-360 (2012).
- Budnik, V., Zhong, Y., Wu, C. F. Morphological plasticity of motor axons in Drosophila mutants with altered excitability. Journal of Neuroscience. 10 (11), 3754-3768 (1990).
- Zhang, X., et al. Neuroligin 4 regulates synaptic growth via the bone morphogenetic protein (BMP) signaling pathway at the Drosophila neuromuscular junction. Journal of Biological Chemistry. 292 (44), 17991-18005 (2017).
- Wu, S., et al. A pre-synaptic function of shank protein in Drosophila. Journal of Neuroscience. 37 (48), 11592-11604 (2017).
- Gan, G., Lv, H., Xie, W. Morphological identification and development of neurite in Drosophila ventral nerve cord neuropil. PLoS One. 9 (8), 105497 (2014).
