Dit rapport biedt een nieuwe procedure voor de voorbereiding van monsters voor het visualiseren van neuromusculaire juncties in Drosophila-larven . Deze methode is effectiever in het voorkomen van het krullen van de monsters in vergelijking met de traditionele methode en is met name nuttig voor de ultrastructurele analyse van de neuromusculaire junctie van Drosophila .
De Drosophila neuromusculaire junctie (NMJ) is naar voren gekomen als een waardevol modelsysteem op het gebied van neurowetenschappen. De toepassing van confocale microscopie in de Drosophila NMJ stelt onderzoekers in staat om synaptische informatie te verkrijgen, die zowel kwantitatieve gegevens over de overvloed aan synapsen als gedetailleerde inzichten in hun morfologie omvat. De diffuse verdeling en het beperkte visuele bereik van de TEM vormen echter een uitdaging voor de ultrastructurele analyse. Deze studie introduceert een innovatieve en efficiënte methode voor monstervoorbereiding die de conventionele aanpak overtreft. De procedure begint met het plaatsen van een metalen gaas op de bodem van een fles of reageerbuis met platte bodem, gevolgd door het plaatsen van vaste larvenmonsters op het gaas. Een extra gaas wordt over de monsters geplaatst en zorgt ervoor dat ze tussen de twee mazen worden geplaatst. De vaste monsters worden grondig gedehydrateerd en geïnfiltreerd voordat wordt overgegaan tot de inbeddingsprocedure. Vervolgens wordt het inbedden van de monsters in epoxyhars uitgevoerd op een vlakke plaat, waardoor de spieren kunnen worden voorbereid op positionering en secties. Door gebruik te maken van deze stappen kunnen alle spieren van Drosophila-larven worden gevisualiseerd met lichtmicroscopie, waardoor de daaropvolgende positionering en secties worden vergemakkelijkt. Overtollig hars wordt verwijderd na het lokaliseren van de6e en 7espieren van lichaamssegmenten A, 2 en A, 3. Seriële ultradunne secties van de 6eof 7espier worden uitgevoerd.
Elektronenmicroscopie is een van de meest ideale methoden voor het bestuderen van de ultrastructuur van biologische materialen die de interne structuur van cellen op nanoschaalniveau1 visueel en nauwkeurig kunnen aantonen. Vanwege de complexiteit van het monstervoorbereidingsproces en de hoge kosten is elektronenmicroscopie echter niet zo populair als lichtmicroscopie. Recente ontwikkelingen in elektronenmicroscopietechnieken hebben geleid tot aanzienlijke verbeteringen in de beeldkwaliteit, wat samenvalt met een opmerkelijke vermindering van de bijbehorende werklast. Elektronenmicroscopie heeft dan ook een belangrijke rol gespeeld bij het bevorderen van wetenschappelijke kennis op diverse gebieden2.
Drosophila is een uitstekend diermodel voor het uitvoeren van genetische manipulaties om de ruimtelijke en temporele expressie van doelgenen nauwkeurig te regelen3. Bovendien heeft Drosophila de voordelen van een korte groeiperiode en gemakkelijke opfok in vergelijking met zoogdiermodellen; daarom wordt Drosophila veel gebruikt in morfologieonderzoek 4,5.
Bij Drosophila-larven zijn neuromusculaire junctie (NMJ) boutons wijd verspreid in de spieren 6,7, en immunokleuring van NMJ kan gemakkelijk informatie geven over de hoeveelheid synaps en morfologie 8,9 . De NMJ-boutons die zich in de 6e/7espieren van deA2- en A3-segmenten bevinden, zijn zeer geschikt voor kwantitatief en morfologisch onderzoek met behulp van lichtmicroscopie. Dit komt door hun grootte en overvloed10,11. Daarom worden Drosophila-larven NMJ’s beschouwd als een nuttig model voor neurowetenschappelijk onderzoek12.
Het is echter een uitdaging om de NMJ bouton-ultrastructuur door de TEM waar te nemen. Omdat het scanvenster van transmissie-elektronenmicroscopie smal is, is het moeilijk om de wijdverspreide NMJ-boutons13 te positioneren. De andere reden is dat de lichaamswand van Drosophila gevoelig is voor krullen tijdens de alcoholuitdrogingsstap van het monstervoorbereidingsprotocol7.
Traditionele studies hebben meestal boutons tussen de 6ees 7espieren van de A, 2 en A3 segmenten gekozen als monstermateriaal vanwege hun overvloed en grootte14,15. De 6ees 7espieren van deA2– enA3-segmenten zijn groter dan de andere spieren en bevatten meer boutons. Wanneer monsters echter werden voorbereid voor elektronenmicroscopie, hadden vaste monsters de neiging dun te worden en vatbaar voor krullen, wat leidde tot een onjuiste positionering van de 6ees 7espieren van de A2 en A3 segmenten.
Hierbij rapporteren we een nieuwe verwerkingsprocedure die effectiever is in het voorkomen van het krullen van de monsters in vergelijking met de traditionele methode van monstervoorbereiding 7,16, door de monsters plat te laten blijven tijdens de daaropvolgende uitdroging, waardoor een betere positionering van de neuromusculaire knooppunten van de Drosophila-larven wordt vergemakkelijkt.
Monsters van Drosophila-larven hebben de neiging om op te krullen tijdens uitdroging, omdat de monsters dun zijn, waardoor het moeilijk is om de neuromusculaire overgang nauwkeurig te lokaliseren, waardoor de moeilijkheidsgraad en werklast voor de monstervoorbereiding toenemen. De traditionele verbetering is om de steekproef7 in te korten, maar de steekproeven waren nog steeds in verschillende mate gekruld.
In onze methode zijn er twee cruciale stappen: ten eer…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door de Natural Science Foundation of China Grant 32070811 en het Southeast University (China) Analysis Test Fund 11240090971. We danken het Laboratorium voor Elektronenmicroscopie en het Centrum voor Morfologische Analyse, School of Medicine, Southeast University, Nanjing, China.
1,2-Epoxypropane | SHANGHAI LING FENG CHEMICAL REAGENT CO., LTD | JYJ 037-2015 | Penetrating Agent |
Drosophila Stocks | Bloomington | none | The wild-type control Drosophila strains used in this research were all W1118, and were reared according to standard culture methods |
Flat-bottomed glass test tubes | Haimen Chenxing Experimental equipment Company | none | Flat-bottomed glass test tubes(bottle)with sponge plug(or bottle stopper) |
K4M cross-linker | Agar Scientific | Cat# 1924B | The embedding resins are based on a highly cross-linked acrylate and methacrylate formula |
K4M resin (monomer B) | Agar Scientific | Lot# 631557 | Resin Monomer |
Polyvinyl film | Haimen Chenxing Experimental equipment Company | none | Transparent polyethylene film is the best , thickness of about 0.2mm |
SPI Chem DDSA | SPI | SpI#02827-AF | Dodecenyl Succinic Anhydride |
SPI-Chem DMP-30 Epoxy | SPI | 02823-DA | Accelerator |
SPI-Chem NMA | SPI | SpI#02828-AF | Hardner for Epoxy |
SPI-PON 812 Epoxy | SPI | SPI#0259-AB | Resin Monomer |
Steel mesh | Yuhuiyuan Gardening Store(online) | none | Copper or stainless steel net |
Transmission electron microscopy | Hitachi H-7650 | 11416692 | All grids (on which samples were gathered) were stained with lead citrate and observed under a transmission electron microscopy. |
Ultrathin microtome | Leica UC7 ultrathin microtome | 595915 | All sectioning operations are carried out on a Leica UC7 ultrathin microtome using a diamond knife |