인간 코로나바이러스-숙주 상호작용을 특성화하기 위해 공기-액체 계면에서 성장한 일차 비강 상피 세포의 감염
Summary
비강 상피는 모든 호흡기 병원체가 만나는 주요 장벽 부위입니다. 여기에서는 생리학적으로 관련된 시스템에서 인간 코로나바이러스-숙주 상호 작용을 특성화하기 위해 공기-액체 인터페이스(ALI) 배양으로 성장한 일차 비강 상피 세포를 사용하는 방법을 간략하게 설명합니다.
Abstract
SARS-CoV(2002년), MERS-CoV(2012년), SARS-CoV-2(2019년)의 세 가지 고병원성 인간 코로나바이러스(HCoV)가 출현하여 지난 20년 동안 심각한 공중 보건 위기를 초래했습니다. 매년 4개의 추가 HCoV(HCoV-NL63, -229E, -OC43 및 -HKU1)가 일반적인 감기 사례의 상당 부분을 유발하며, 이는 생리학적으로 관련된 시스템에서 이러한 바이러스를 연구하는 것의 중요성을 강조합니다. HCoV는 호흡기로 들어가 모든 호흡기 병원체가 만나는 주요 부위인 비강 상피에 감염을 일으킵니다. 당사는 환자 유래 비강 샘플이 공기-액체 계면(ALI)에서 배양되는 1차 비강 상피 배양 시스템을 사용하여 이 중요한 감시 부위에서 숙주-병원체 상호 작용을 연구합니다. 이러한 배양은 존재하는 세포 유형, 섬모 기능 및 점액 생성을 포함하여 생체 내 기도의 많은 특징을 요약합니다. 치사량과 계절성 HCoV를 비교한 최근 연구를 예시1로 사용하여 HCoV 감염 후 비강 ALI 배양에서 바이러스 복제, 숙주 세포 영양성, 바이러스 유도 세포 독성 및 선천성 면역 유도를 특성화하는 방법을 설명합니다. 코에서 숙주-병원체 상호 작용에 대한 이해가 높아짐에 따라 HCoV 및 향후 등장할 가능성이 있는 기타 호흡기 바이러스에 대한 항바이러스 치료제의 새로운 표적을 제공할 수 있습니다.
Introduction
현재까지 7종의 인간 코로나바이러스(HCoV)가 확인되었으며 다양한 호흡기 질환을 유발합니다2. 일반적인 또는 계절성 HCoV(HCoV-NL63, -229E, -OC43 및 -HKU1)는 일반적으로 상기도 병리와 관련이 있으며 매년 일반적인 감기 사례의 약 10%-30%를 유발합니다. 이는 일반적인 HCoV와 관련된 전형적인 임상 표현형이지만, 이러한 바이러스는 어린이, 노인 및 면역 저하자를 포함한 위험에 처한 인구 집단에서 더 심각한 하기도 질환을 유발할 수 있습니다 3,4. 중증급성호흡기증후군(SARS)-CoV, 중동호흡기증후군(MERS)-CoV, SARS-CoV-2 등 3가지 병원성 HCoV가 출현하여 지난 20년 동안 심각한 공중보건 비상사태를 일으켰습니다. 치명적 HCoV는 더 심각한 호흡기 병리와 관련이 있으며, 이는 MERS-CoV 사례와 관련된 >34%의 치사율(2012년 출현 이후 2,500건 이상의 사례에서 894명 사망)5,6으로 명확하게 설명됩니다. 또한 현재 진행 중인 COVID-19 팬데믹에서 볼 수 있듯이 치명적인 HCoV는 무증상 감염에서 치명적인 폐렴에 이르기까지 다양한 호흡기 질환을 유발한다는 점에 유의해야 합니다7.
HCoV는 다른 호흡기 병원체와 마찬가지로 호흡기로 들어가 비강 상피에 생산적인 감염을 일으킨다8. 하기도로의 전이는 구강/비강에서 폐로의 흡인과 관련이 있는 것으로 생각되며, 여기서 HCoV는 더 심각한 하기도 병리를 유발한다 9,10,11. 따라서, 코는 바이러스 진입을 위한 초기 관문 역할을 하며, 강력한 점액섬모 제거 기계와 하부 기도로의 바이러스 확산을 막기 위한 독특한 선천성 면역 기전을 통해 감염에 대한 주요 장벽이 된다12,13. 예를 들어, 비강 상피세포는 항바이러스 인터페론 및 인터페론 자극 유전자의 평균 기초 수준보다 높은 발현을 하는 것으로 보고되었으며, 이는 비강 세포가 호흡기 바이러스에 대한 조기 반응을 위해 준비될 수 있음을 나타냅니다14,15,16.
우리는 이전에 HCoV 감염이 시작되는 코에서 HCoV-숙주 상호 작용을 모델링하기 위해 공기-액체 인터페이스(ALI)에서 성장한 환자 유래 일차 비강 상피 세포를 활용했습니다. 비강 ALI 배양은 병원성(SARS-CoV-2 및 MERS-CoV)과 일반적인 HCoV(HCoV-NL63 및 HCoV-229E) 모두에 허용되며 A549(폐 선암 세포주)16,17와 같은 기존 기도 상피 세포주에 비해 다양한 이점을 제공합니다. 분화 후, 비강 ALI 배양물은 이질적인 세포 집단을 포함하며, 점액섬모 청소 기계(mucociliary clearance mechanism)와 같은 생체 내 비강 상피에서 기대되는 많은 기능을 나타낸다18. 또한 비강 세포는 하부 기도 배양 시스템(예: 인간 기관지 상피 세포, HBEC)에 비해 이점을 제공하는데, 이는 세포학적 칫솔질을 통한 비강 상피 세포 획득이 HBECs 19,20,21을 얻기 위해 기관지 내시경과 같은 기술을 사용하는 것에 비해 훨씬 덜 침습적이기 때문입니다.
이 논문은 이 비강 ALI 배양 시스템을 활용하여 비강 상피에서 HCoV-숙주 상호작용을 특성화하는 방법을 설명합니다. SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 및 HCoV-229E를 비교하기 위해 최근 발표된 연구에서 이러한 방법을 적용했습니다 1,16,17. 이러한 방법과 대표적인 결과는 이 비강 세포 모델에서 HCoV에 대한 연구를 강조하지만, 이 시스템은 다른 HCoV 및 기타 호흡기 병원체에 매우 잘 적응합니다. 또한, 이러한 방법은 바이러스 복제 및 세포 영양성뿐만 아니라 감염 후 세포 독성 및 선천성 면역 유도를 조사하기 위해 다른 ALI 배양 시스템에 더 광범위하게 적용될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 자세히 설명된 방법은 환자 유래 비강 상피 세포가 공기-액체 계면에서 성장하고 HCoV-숙주 상호 작용 연구에 적용되는 1차 상피 배양 시스템을 설명합니다. 일단 분화되면, 이러한 비강 ALI 배양은 섬모, 잔 및 기저 세포가 대표되는 이질적인 세포 집단뿐만 아니라 섬모와 점액 분비가 강력하게 박동하는 온전한 점액 섬모 기능을 포함하여 생체 내 비강 상피의 많은 특징을 요약합니다…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구의 자금 출처는 다음과 같습니다: 미국 국립보건원(NIH) R01AI 169537(S.R.W. 및 N.A.C.), NIH R01AI 140442(S.R.W.), VA Merit Review CX001717(N.A.C.), VA Merit Review BX005432(S.R.W. 및 N.A.C.), Penn Center for Research on Coronaviruses and other Emerging Pathogens(S.R.W.), Laffey-McHugh Foundation(S.R.W. 및 N.A.C.), T32 AI055400(CJO), T32 AI007324(AF).
Materials
| Alexa Fluor secondary antibodies (488, 594, 647) | Invitrogen | Various | |
| BSA (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| cOmplete mini EDTA-free protease inhibitor | Roche | 11836170001 | |
| Cytotoxicity detection kit | Roche | 11644793001 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) | Gibco | 11965-084 | |
| DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Gibco | 14190136 | |
| DPBS + calcium + magnesium | Gibco | 14040-117 | |
| Endohm-6G measurement chamber | World Precision Instruments | ENDOHM-6G | |
| Epithelial cell adhesion marker (EpCAM; CD326) | eBiosciences | 14-9326-82 | |
| Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM) | World Precision Instruments | 300523 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | HyClone | SH30071.03 | |
| FV10-ASW software for imaging | Olympus | Version 4.02 | |
| HCoV-NL63 (Human coronavirus, NL63) | BEI Resources | NR-470 | |
| HCoV-NL63 nucleocapsid antibody | Sino Biological | 40641-V07E | |
| Hoescht stain | Thermo Fisher | H3570 | |
| Laemmli sample buffer (4x) | BIO-RAD | 1610747 | |
| LLC-MK2 cells | ATCC | CCL-7 | To titrate HCoV-NL63 |
| MERS-CoV (Human coronavirus, Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV), EMC/2012) | BEI Resources | NR-44260 | |
| MERS-CoV nucleocapsid antibody | Sino Biological | 40068-MM10 | |
| MUC5AC antibody | Sigma-Aldrich | AMAB91539 | |
| Olympus Fluoview confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Phalloidin-iFluor 647 stain | Abcam | ab176759 | |
| PhosStop easy pack (phosphatase inhibitors) | Roche | PHOSS-RO | |
| Plate reader | Perkin Elmer | HH34000000 | Any plate reader or ELISA reader is sufficient; must be able to read absorbance at 492 nm |
| RIPA buffer (50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; 0.5% deoxycholate; 0.1% SDS; 1% NP40) | Thermo Fisher | 89990 | Can prep in-house or purchase |
| RNeasy Plus Kit | Qiagen | 74134 | |
| SARS-CoV-2 (SARS-Related Coronavirus 2, Isolate USA-WA1/2020) | BEI Resources | NR-52281 | |
| SARS-CoV-2 nucleocapsid antibody | Genetex | GTX135357 | |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151100 | |
| Type IV β- tubulin antibody | Abcam | ab11315 | |
| VeroCCL81 cells | ATCC | CCL-81 | To titrate MERS-CoV |
| VeroE6 cells | ATCC | CRL-1586 | To titrate SARS-CoV-2 |
Referencias
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