Infection de cellules épithéliales nasales primaires cultivées à l’interface air-liquide pour caractériser les interactions entre le coronavirus humain et l’hôte
Summary
L’épithélium nasal est le principal site barrière rencontré par tous les agents pathogènes respiratoires. Ici, nous décrivons des méthodes pour utiliser des cellules épithéliales nasales primaires cultivées sous forme de cultures d’interface air-liquide (ALI) pour caractériser les interactions entre le coronavirus humain et l’hôte dans un système physiologiquement pertinent.
Abstract
Trois coronavirus humains hautement pathogènes (HCoV) – le SRAS-CoV (2002), le MERS-CoV (2012) et le SRAS-CoV-2 (2019) – ont émergé et provoqué d’importantes crises de santé publique au cours des 20 dernières années. Quatre autres HCoV sont à l’origine d’une part importante des cas de rhume chaque année (HCoV-NL63, -229E, -OC43 et -HKU1), ce qui souligne l’importance d’étudier ces virus dans des systèmes physiologiquement pertinents. Les HCoV pénètrent dans les voies respiratoires et établissent l’infection dans l’épithélium nasal, le site principal rencontré par tous les agents pathogènes respiratoires. Nous utilisons un système de culture épithéliale nasale primaire dans lequel des échantillons nasaux dérivés de patients sont cultivés à une interface air-liquide (ALI) pour étudier les interactions hôte-pathogène sur cet important site sentinelle. Ces cultures récapitulent de nombreuses caractéristiques des voies respiratoires in vivo , y compris les types de cellules présentes, la fonction ciliaire et la production de mucus. Nous décrivons des méthodes pour caractériser la réplication virale, le tropisme de la cellule hôte, la cytotoxicité induite par le virus et l’induction immunitaire innée dans les cultures nasales d’ALI après une infection par HCoV, en utilisant des travaux récents comparant les HCoV létaux et saisonniers comme exemple1. Une meilleure compréhension des interactions hôte-pathogène dans le nez a le potentiel de fournir de nouvelles cibles pour les thérapies antivirales contre les HCoV et d’autres virus respiratoires qui émergeront probablement à l’avenir.
Introduction
Sept coronavirus humains (HCoV) ont été identifiés à ce jour et provoquent une série de maladies respiratoires2. Les HCoV courants ou saisonniers (HCoV-NL63, -229E, -OC43 et -HKU1) sont généralement associés à une pathologie des voies respiratoires supérieures et causent environ 10 à 30 % des cas de rhume chaque année. Bien qu’il s’agisse du phénotype clinique typique associé aux HCoV courants, ces virus peuvent causer des maladies des voies respiratoires inférieures plus importantes dans les populations à risque, y compris les enfants, les personnes âgées et les personnes immunodéprimées 3,4. Au cours des 20 dernières années, trois HCoV pathogènes ont émergé et causé d’importantes urgences de santé publique, notamment le syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS)-CoV, le syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS)-CoV et le SRAS-CoV-2. Les HCoV létaux sont associés à une pathologie plus sévère des voies respiratoires, ce qui est clairement illustré par le taux de létalité de >34 % associé aux cas de MERS-CoV (894 décès pour plus de 2 500 cas depuis son apparition en 2012)5,6. Il est important de noter que les HCoV mortels causent également toute une série de maladies des voies respiratoires, allant des infections asymptomatiques à la pneumonie mortelle, comme on l’a vu avec la pandémie de COVID-19 en cours7.
Les HCoV, comme d’autres agents pathogènes respiratoires, pénètrent dans les voies respiratoires et établissent une infection productive dans l’épithélium nasal8. On pense que la propagation aux voies respiratoires inférieures est associée à l’aspiration de la cavité buccale/nasale vers le poumon, où les HCoV provoquent une pathologie plus importante des voies respiratoires inférieures 9,10,11. Ainsi, le nez sert de porte initiale pour l’entrée virale et constitue la principale barrière à l’infection grâce à sa robuste machinerie de clairance mucociliaire et à ses mécanismes immunitaires innés uniques visant à empêcher la propagation virale vers les voies respiratoires inférieures12,13. Par exemple, il a été rapporté que les cellules épithéliales nasales expriment des niveaux basaux plus élevés que la moyenne d’interférons antiviraux et de gènes stimulés par l’interféron, ce qui indique que les cellules nasales peuvent être préparées à des réponses précoces aux virus respiratoires14,15,16.
Nous avons déjà utilisé des cellules épithéliales nasales primaires dérivées de patients cultivées à l’interface air-liquide (ALI) pour modéliser les interactions HCoV-hôte dans le nez, où les infections HCoV commencent. Les cultures nasales d’ALI sont permissives pour les HCoV pathogènes (SRAS-CoV-2 et MERS-CoV) et communs (HCoV-NL63 et HCoV-229E) et offrent divers avantages par rapport aux lignées cellulaires épithéliales traditionnelles des voies respiratoires telles que A549 (une lignée cellulaire d’adénocarcinome pulmonaire)16,17. Après différenciation, les cultures nasales d’ALI contiennent une population cellulaire hétérogène et présentent de nombreuses fonctions attendues de l’épithélium nasal in vivo, telles que la machinerie de clairance mucociliaire18. Les cellules nasales offrent également des avantages par rapport aux systèmes de culture des voies respiratoires inférieures (tels que les cellules épithéliales bronchiques humaines, HBEC), car l’acquisition de cellules épithéliales nasales par brossage cytologique est nettement moins invasive que l’utilisation de techniques telles que la bronchoscopie pour atteindre les HBECs 19,20,21.
Cet article décrit les méthodes d’utilisation de ce système de culture ALI nasale pour caractériser les interactions HCoV-hôte dans l’épithélium nasal. Nous avons appliqué ces méthodes dans des travaux récemment publiés pour comparer le SARS-CoV-2, le MERS-CoV, le HCoV-NL63 et le HCoV-229E 1,16,17. Bien que ces méthodes et ces résultats représentatifs mettent l’accent sur l’étude des HCoV dans ce modèle de cellules nasales, le système est hautement adaptable à d’autres HCoV, ainsi qu’à d’autres agents pathogènes respiratoires. De plus, ces méthodes peuvent être appliquées plus largement à d’autres systèmes de culture ALI afin d’étudier la réplication virale et le tropisme cellulaire, ainsi que la cytotoxicité et l’induction immunitaire innée après l’infection.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les méthodes détaillées ici décrivent un système de culture épithéliale primaire dans lequel des cellules épithéliales nasales dérivées de patients sont cultivées à une interface air-liquide et appliquées à l’étude des interactions HCoV-hôte. Une fois différenciées, ces cultures nasales d’ALI récapitulent de nombreuses caractéristiques de l’épithélium nasal in vivo , y compris une population cellulaire hétérogène avec des cellules ciliées, caliciformes et basales représentées, …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude bénéficie des sources de financement suivantes : National Institutes of Health (NIH) R01AI 169537 (S.R.W. et N.A.C.), NIH R01AI 140442 (S.R.W.), VA Merit Review CX001717 (N.A.C.), VA Merit Review BX005432 (S.R.W. et N.A.C.), Penn Center for Research on Coronaviruses and other Emerging Pathogens (S.R.W.), Laffey-McHugh Foundation (S.R.W. et N.A.C.), T32 AI055400 (CJO), T32 AI007324 (AF).
Materials
| Alexa Fluor secondary antibodies (488, 594, 647) | Invitrogen | Various | |
| BSA (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| cOmplete mini EDTA-free protease inhibitor | Roche | 11836170001 | |
| Cytotoxicity detection kit | Roche | 11644793001 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) | Gibco | 11965-084 | |
| DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Gibco | 14190136 | |
| DPBS + calcium + magnesium | Gibco | 14040-117 | |
| Endohm-6G measurement chamber | World Precision Instruments | ENDOHM-6G | |
| Epithelial cell adhesion marker (EpCAM; CD326) | eBiosciences | 14-9326-82 | |
| Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM) | World Precision Instruments | 300523 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | HyClone | SH30071.03 | |
| FV10-ASW software for imaging | Olympus | Version 4.02 | |
| HCoV-NL63 (Human coronavirus, NL63) | BEI Resources | NR-470 | |
| HCoV-NL63 nucleocapsid antibody | Sino Biological | 40641-V07E | |
| Hoescht stain | Thermo Fisher | H3570 | |
| Laemmli sample buffer (4x) | BIO-RAD | 1610747 | |
| LLC-MK2 cells | ATCC | CCL-7 | To titrate HCoV-NL63 |
| MERS-CoV (Human coronavirus, Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV), EMC/2012) | BEI Resources | NR-44260 | |
| MERS-CoV nucleocapsid antibody | Sino Biological | 40068-MM10 | |
| MUC5AC antibody | Sigma-Aldrich | AMAB91539 | |
| Olympus Fluoview confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Phalloidin-iFluor 647 stain | Abcam | ab176759 | |
| PhosStop easy pack (phosphatase inhibitors) | Roche | PHOSS-RO | |
| Plate reader | Perkin Elmer | HH34000000 | Any plate reader or ELISA reader is sufficient; must be able to read absorbance at 492 nm |
| RIPA buffer (50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; 0.5% deoxycholate; 0.1% SDS; 1% NP40) | Thermo Fisher | 89990 | Can prep in-house or purchase |
| RNeasy Plus Kit | Qiagen | 74134 | |
| SARS-CoV-2 (SARS-Related Coronavirus 2, Isolate USA-WA1/2020) | BEI Resources | NR-52281 | |
| SARS-CoV-2 nucleocapsid antibody | Genetex | GTX135357 | |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151100 | |
| Type IV β- tubulin antibody | Abcam | ab11315 | |
| VeroCCL81 cells | ATCC | CCL-81 | To titrate MERS-CoV |
| VeroE6 cells | ATCC | CRL-1586 | To titrate SARS-CoV-2 |
Referencias
- Otter, C. J., et al. Infection of primary nasal epithelial cells differentiates among lethal and seasonal human coronaviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 120 (15), 2218083120 (2023).
- Fehr, A., Perlman, S. Coronaviruses: An overview of their replication and pathogenesis. Methods in Molecular Biology. 1282, 1-23 (2015).
- Gaunt, E. R., Hardie, A., Claas, E. C. J., Simmonds, P., Templeton, K. E. Epidemiology and clinical presentations of the four human coronaviruses 229E, HKU1, NL63, and OC43 detected over 3 years using a novel multiplex real-time PCR method. Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2940-2947 (2010).
- Kesheh, M. M., Hosseini, P., Soltani, S., Zandi, M. An overview on the seven pathogenic human coronaviruses. Reviews in Medical Virology. 32 (2), 2282 (2022).
- MERS-CoV Worldwide Overview. European Centre for Disease Prevention and Control Available from: https://www.ecdc.europa.eu/en/middle-east-respiratory-syndrome-coronavirus-mers-cov-situation-update (2022)
- Cao, Y., Liu, X., Xiong, L., Cai, K. Imaging and clinical features of patients with 2019 novel coronavirus SARS-CoV-2: A systematic review and meta-analysis. Journal of Medical Virology. 92 (9), 1449-1459 (2020).
- Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. The airway epithelium: Soldier in the fight against respiratory viruses. Clinical Microbiology Reviews. 24 (1), 210-229 (2011).
- Farzal, Z., et al. Comparative study of simulated nebulized and spray particle deposition in chronic rhinosinusitis patients. International Forum of Allergy and Rhinology. 9 (7), 746-758 (2019).
- Gaeckle, N. T., Pragman, A. A., Pendleton, K. M., Baldomero, A. K., Criner, G. J. The oral-lung axis: The impact of oral health on lung health. Respiratory Care. 65 (8), 1211-1220 (2020).
- Hou, Y., et al. SARS-CoV-2 reverse genetics reveals a variable infection gradient in the respiratory tract. Cell. 182, 429-446 (2020).
- Hariri, B. M., Cohen, N. A. New insights into upper airway innate immunity. American Journal of Rhinology and Allergy. 30 (5), 319-323 (2016).
- Hiemstra, P. S., McCray, P. B., Bals, R. The innate immune function of airway epithelial cells in inflammatory lung disease. European Respiratory Journal. 45 (4), 1150-1162 (2015).
- Hatton, C. F., et al. Delayed induction of type I and III interferons mediates nasal epithelial cell permissiveness to SARS-CoV-2. Nature Communications. 12 (1), 7092 (2021).
- Sungnak, W., et al. SARS-CoV-2 entry factors are highly expressed in nasal epithelial cells together with innate immune genes. Nature Medicine. 26 (5), 681-687 (2020).
- Li, Y., et al. SARS-CoV-2 induces double-stranded RNA-mediated innate immune responses in respiratory epithelial-derived cells and cardiomyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (16), 2022643118 (2021).
- Comar, C. E., et al. MERS-CoV endoribonuclease and accessory proteins jointly evade host innate immunity during infection of lung and nasal epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (21), 2123208119 (2022).
- Lee, R. J., et al. Bacterial D-amino acids suppress sinonasal innate immunity through sweet taste receptors in solitary chemosensory cells. Science Signaling. 10 (495), (2017).
- Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), 99385 (2018).
- Comer, D. M., Elborn, J. S., Ennis, M. Comparison of nasal and bronchial epithelial cells obtained from patients with COPD. PLoS One. 7 (3), e32924 (2012).
- Vanders, R. L., Hsu, A., Gibson, P. G., Murphy, V. E., Wark, P. A. B. Nasal epithelial cells to assess in vitro immune responses to respiratory virus infection in pregnant women with asthma. Respiratory Research. 20 (1), 259 (2019).
- Lee, R. J., et al. Fungal aflatoxins reduce respiratory mucosal ciliary function. Scientific Reports. 6, 33221 (2016).
- Patel, N. N., et al. Fungal extracts stimulate solitary chemosensory cell expansion in noninvasive fungal rhinosinusitis. International Forum of Allergy and Rhinology. 9 (7), 730-737 (2019).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: Using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments. 93 (93), e52065 (2014).
- Robinot, R., et al. SARS-CoV-2 infection induces the dedifferentiation of multiciliated cells and impairs mucociliary clearance. Nature Communications. 12 (1), 4354 (2021).
- Whitsett, J. A. Airway epithelial differentiation and mucociliary clearance. Annals of the American Thoracic Society. 15, S143-S148 (2018).
- Gao, N., Raduka, A., Rezaee, F. Respiratory syncytial virus disrupts the airway epithelial barrier by decreasing cortactin and destabilizing F-actin. Journal of Cell Science. 135 (16), 259871 (2022).
- Schmidt, H., et al. IL-13 impairs tight junctions in airway epithelia. International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3222 (2019).
- Huang, Z. Q., et al. Interleukin-13 alters tight junction proteins expression thereby compromising barrier function and dampens rhinovirus induced immune responses in nasal epithelium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 572749 (2020).
- Saatian, B., et al. Interleukin-4 and interleukin-13 cause barrier dysfunction in human airway epithelial cells. Tissue Barriers. 1 (2), e24333 (2013).
- Coles, J. L., et al. A revised protocol for culture of airway epithelial cells as a diagnostic tool for primary ciliary dyskinesia. Journal of Clinical Medicine. 9 (11), 3753 (2020).
- Baldassi, D., Gabold, B., Merkel, O. M. Air−liquid interface cultures of the healthy and diseased human respiratory tract: Promises, challenges, and future directions. Advanced NanoBiomed Research. 1 (6), 2000111 (2021).
- Seibold, M. A. Interleukin-13 stimulation reveals the cellular and functional plasticity of the airway epithelium. Annals of the American Thoracic Society. 15, S98-S106 (2018).
- Morrison, C. B., et al. SARS-CoV-2 infection of airway cells causes intense viral and cell shedding, two spreading mechanisms affected by IL-13. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (16), 2119680119 (2022).
