نقدم طريقة لقياس تعود Stentor باستخدام جهاز مرتبط بلوحة التحكم الدقيقة يمكنه توصيل نبضات ميكانيكية بقوة وتردد محددين. نقوم أيضا بتضمين طرق لتجميع الجهاز وإعداد التجربة بطريقة تقلل من الاضطرابات الخارجية.
عادة ما يرتبط التعلم بجهاز عصبي معقد ، ولكن هناك أدلة متزايدة على أن الحياة على جميع المستويات ، وصولا إلى الخلايا المفردة ، يمكن أن تظهر سلوكيات ذكية. في كل من الأنظمة الطبيعية والاصطناعية ، التعلم هو التحديث التكيفي لمعلمات النظام بناء على معلومات جديدة ، والذكاء هو مقياس للعملية الحسابية التي تسهل التعلم. Stentor coeruleus هو كائن حي وحيد الخلية يعيش في البركة ويظهر التعود ، وهو شكل من أشكال التعلم تنخفض فيه الاستجابة السلوكية بعد التحفيز المتكرر. تتقلص الدعامة استجابة للتحفيز الميكانيكي ، وهي استجابة واضحة للهروب من الحيوانات المفترسة المائية. ومع ذلك ، فإن الاضطرابات المتكررة منخفضة القوة تحفز التعود ، كما يتضح من الانخفاض التدريجي في احتمال الانكماش. هنا ، نقدم طريقة لقياس ارتياد Stentor باستخدام جهاز مرتبط بلوحة التحكم الدقيقة يمكنه توصيل نبضات ميكانيكية بقوة وتردد محددين ، بما في ذلك طرق بناء الجهاز وإعداد التجربة بطريقة تقلل من الاضطرابات الخارجية. على عكس الأساليب الموصوفة سابقا لتحفيز Stentor ميكانيكيا ، يسمح هذا الجهاز بتغيير قوة التحفيز تحت تحكم الكمبيوتر أثناء تجربة واحدة ، مما يزيد بشكل كبير من تنوع تسلسلات الإدخال التي يمكن تطبيقها. سيساعد فهم التعود على مستوى خلية واحدة في توصيف نماذج التعلم المستقلة عن الدوائر المعقدة.
عادة ما يرتبط التعلم بجهاز عصبي معقد ، ولكن هناك أدلة متزايدة على أن الحياة على جميع المستويات ، وصولا إلى الخلايا المفردة ، يمكن أن تظهر سلوكيات ذكية. في كل من الأنظمة الطبيعية والاصطناعية ، التعلم هو التحديث التكيفي لمعلمات النظام بناء على المعلومات الجديدة1 ، والذكاء هو مقياس للعملية الحسابية التي تسهل التعلم2.
Stentor coeruleus هو كائن حي وحيد الخلية يعيش في البركة يظهر التعود ، وهو شكل من أشكال التعلم تنخفض فيه الاستجابة السلوكية بعد التحفيز المتكرر3. ينقبض Stentor استجابة للتحفيز الميكانيكي3 ، وهو استجابة هروب واضحة من الحيوانات المفترسة المائية. ومع ذلك ، فإن الاضطرابات المتكررة منخفضة القوة تحفز التعود ، كما يتضح من الانخفاض التدريجي في احتمال الانكماش3. لا يزال Stentor المعتاد ينقبض بعد تلقي التحفيز الميكانيكي عالي القوة4 أو التحفيز الفوتيكي5. تشير هذه الملاحظات ، التي تتوافق مع معايير طومسون وسبنسر الكلاسيكية للتعود في الحيوانات6 ، بقوة إلى أن انخفاض الاستجابة الانقباضية الأصلي يرجع إلى التعلم بدلا من التعب أو استنفاد ATP. كخلية حية حرة ، يمكن دراسة Stentor دون تدخل كبير من الخلايا المحيطة ، كما هو الحال في الأنسجة متعددة الخلايا. العديد من الميزات الإضافية تجعل Stentor نظاما قابلا للتتبع لدراسة التعلم: حجمه الكبير (1 مم) ، واستجابة التعود القابلة للقياسالكمي 3 ، وسهولة الحقن والمعالجة الدقيقة7 ، والجينومالمتسلسل بالكامل 8 ، وتوافر أدوات تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi)9. يتطلب استخدام هذا الكائن الحي النموذجي لاستكشاف التعلم الخلوي بدون دماغ أو جهاز عصبي إجراء قابل للتكرار لتحفيز خلايا Stentor وقياس الاستجابة.
هنا ، نقدم طريقة لقياس ارتياد Stentor باستخدام جهاز مرتبط بلوحة التحكم الدقيقة يمكنه توصيل نبضات ميكانيكية بقوة وتردد محددين ، بما في ذلك طرق بناء الجهاز وإعداد التجربة بطريقة تقلل من الاضطرابات الخارجية (الشكل 1). سيساعد فهم التعود على مستوى خلية واحدة في توصيف نماذج التعلم المستقلة عن الدوائر المعقدة.
الشكل 1: إعداد تجربة التعود. يتم وضع لوحة Petri التي تحتوي على Stentor فوق المسطرة المعدنية المرنة لجهاز التعود. ثم يصطدم حديد التسليح لجهاز التعود بالمسطرة المعدنية بقوة وتردد محددين ، مما ينتج عنه موجة تحفيز عبر مجال الخلايا. تسجل كاميرا مجهر USB استجابات Stentor للتحفيز. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: ملخص سير عمل تجربة التعود. يوضح الشكل الخطوات الأساسية التي تنطوي عليها دراسة Stentor باستخدام جهاز التعود. تم إنشاء الرقم مع BioRender.com. مقتبس من “مخطط انسيابي العملية” ، بواسطة BioRender.com (2022). تم الاسترجاع من https://app.biorender.com/biorender-templates. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
تتعلق أهم الخطوات في البروتوكول بضمان بقاء Stentor في الظروف المثلى لحدوث الانقباضات. تتطلب استجابة الانكماش في مقايسة التعود أن تكون الدعامات مثبتة على سطح باستخدام ثباتها اللزجة لأنها نادرا ما تنقبض عندما تسبح بحرية. ومع ذلك ، فإن السطح السفلي للوحة بتري 35 مم المستخدمة في تجارب التعود لا يفضي عادة إلى التثبيت ما لم يكن مطليا ببولي أورنيثين. علاوة على ذلك ، لا يمكن تعريض Stentor لأي اضطراب ميكانيكي لمدة لا تقل عن 2 ساعة قبل بدء تجربة التعود لأن مقياس وقت نسيان Stentor هو 2-6 h3. إذا تلقى Stentor تحفيزا ميكانيكيا في غضون 2 ساعة من وقت بدء تجربة التعود ، فهناك احتمال أن يؤدي هذا التحفيز المسبق إلى مستوى طفيف من التعود قبل التجربة ، وبالتالي تقليل احتمالية الانكماش بعد أن يسلم جهاز التعود النبضة الميكانيكية الأولى. أخيرا ، خلال مرحلة التحليل ، من المهم فقط حساب عدد Stentor الذي ينقبض بعد النبض – بدلا من أي تقلصات عفوية عرضية تحدث قبل توصيل النبض – للحصول على قراءة دقيقة لجزء الخلايا التي تقلصت استجابة للتحفيز الميكانيكي.
يمكن تعديل البروتوكول بسهولة لدراسة أنواع مختلفة من ديناميكيات التعود عن طريق تغيير قوة وتردد النبضات الميكانيكية التي يقدمها جهاز التعود. يوفر هذا أيضا فرصة لاستكشاف أنواع أخرى من التعلم ، مثل التوعية ، التي قد تحدث في Stentor. يمكن أيضا تعديل رمز برنامج لوحة التحكم الدقيق نفسه لتقديم أنماط مختلفة من الصنابير الميكانيكية إلى Stentor.
تتمثل إحدى المشكلات المحتملة لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها باستخدام هذا البروتوكول في التردد المنخفض لإرساء Stentor ، مما قد يقيد عدد Stentor الذي يمكن ملاحظته في تجربة التعود. يتم تقليل تردد التثبيت في بعض الأحيان في ثقافات Stentor التي لم يتم تغذيتها مؤخرا أو ملوثة. لمعالجة هذه المشكلة ، يجب على المرء غسل دفعة جديدة من Stentor لبدء ثقافة جديدة وإطعامهم بانتظام وفقا للبروتوكول الموضح في Lin et al.10.
هذا البروتوكول محدود حيث يمكن اختبار لوحة واحدة فقط من Stentor في كل مرة ، مما يؤدي إلى قياسات إنتاجية منخفضة نسبيا. علاوة على ذلك ، لا تسمح البرامج الحالية بأتمتة تحليل الصور أحادية الخلية. وبالتالي ، فإن معظم البيانات التي تم الحصول عليها هي على مستوى السكان. قد تسهل النماذج المستقبلية لجهاز التعود وأدوات تحليل الصور تجارب الخلية الواحدة عالية الإنتاجية.
تمت دراسة التعود في Stentor سابقا باستخدام الطرق التي وصفها Wood3 ، لكن هذا البروتوكول الجديد يسمح بأتمتة التجارب. لا تسمح الأتمتة للباحث بتقديم نبضات ميكانيكية لقوة وتردد محددين فحسب ، بل تسهل أيضا تجارب التعود طويلة المدى حيث يمكن ترك الجهاز يعمل دون إشراف لعدة أيام. علاوة على ذلك ، فإن استخدام محرك متدرج بدلا من الملف اللولبي المستخدم في تجارب وود3 يقلل من خطر إزالة المغناطيسية بمرور الوقت ويسمح أيضا بتغيير قوة التحفيز أثناء تجربة واحدة.
قد تكشف دراسة التعود الخلوي عن رؤى سريرية لحالات مثل اضطراب نقص الانتباه / فرط النشاط (ADHD) ومتلازمة توريت التي يضعف فيها التعود11. قد تكشف آليات تعويد الدعامة أيضا عن نماذج تعلم جديدة غير متشابكة مستقلة عن الدوائر الخلوية المعقدة. وأخيرا، يمكن أن تلهم الأفكار حول التعلم أحادي الخلية طرقا لإعادة برمجة الخلايا داخل الأنسجة متعددة الخلايا، وهي وسيلة محتملة أخرى لمكافحة المرض.
The authors have nothing to disclose.
نشكر تاتيانا ماكوشوك على المناقشات التي لا حصر لها حول تعلم Stentor . تم تمويل هذا العمل من خلال منحة NSF MCB- 2012647 ومنحة المعاهد الوطنية للصحة R35 GM130327 ، وكذلك من خلال جائزة I2CELL من مؤسسة Fourmentin-Guilbert.
0.01% Poly-ornithine | Millipore Sigma | P4957 | Used to coat Petri plate |
35-mm Petri plate | Benz Microscope Optics Center Inc. | L331 | Contains Stentor during experiments |
6-well plate | StemCell Technologies | 38016 | Used to wash Stentor |
Aluminum breadboard, 4" x 24" x 1/2" (x1) | Thorlabs | MB424 | Used to construct habituation device |
Big easy driver stepper motor driver board (x1) | Sparkfun | ROB-12859 | Used to construct habituation device |
Construction rail, 1" x 5'' (x2) | Newport | Newport CR-1 | Used to construct habituation device |
Laptop | Apple Store | https://www.apple.com/macbook-air-m1/ | Connect laptop to USB microscope to visualize experiments |
Large right-angle bracket (x1) | Thorlabs | AP90RL | Used to construct habituation device |
Microcontroller board | Arduino | A000066 | Used to control habituation device |
Nema 17 Stepper Motor Bipolar 59Ncm 2A 84oz.in 48mm 4-Lead | Stepperonline.com | 5-17HS19-2004S1 | Used to construct habituation device |
Pasteurized spring water | Carolina | 132458 | Media for Stentor experiments |
Right-angle bracket (x3) | Thorlabs | AP90 | Used to construct habituation device |
Stemi 2000 stereo microscope | Zeiss | Used to visualize Stentor during wash steps | |
Stentor coeruleus | Carolina | 131598 | These are the cells used for habituation experiments |
USB microscope | Celestron | 44308 | Used to visualize and record experiments |
Webcam recorder | Apple Store | https://apps.apple.com/us/app/webcam-recorder/id1508067444?mt=12 | Install this application to take videos of experiments |