Изучение привыкания в Stentor coeruleus
Summary
Мы представляем метод количественной оценки привыкания стентора с использованием устройства, связанного с платой микроконтроллера, которое может подавать механические импульсы с заданной силой и частотой. Мы также включаем методы сборки аппарата и постановки эксперимента таким образом, чтобы свести к минимуму внешние возмущения.
Abstract
Обучение обычно связано со сложной нервной системой, но появляется все больше доказательств того, что жизнь на всех уровнях, вплоть до отдельных клеток, может демонстрировать разумное поведение. Как в естественных, так и в искусственных системах обучение — это адаптивное обновление параметров системы на основе новой информации, а интеллект — это мера вычислительного процесса, облегчающая обучение. Stentor coeruleus является одноклеточным прудовым организмом, который проявляет привыкание, форму обучения, при которой поведенческая реакция уменьшается после повторного стимула. Стентор сжимается в ответ на механическую стимуляцию, которая является очевидной реакцией побега от водных хищников. Однако повторяющиеся возмущения с низкой силой вызывают привыкание, о чем свидетельствует прогрессивное снижение вероятности сокращения. Здесь мы представляем метод количественной оценки привыкания Стентора с использованием устройства, связанного с платой микроконтроллера, которое может доставлять механические импульсы с заданной силой и частотой, включая методы построения аппарата и настройки эксперимента таким образом, чтобы минимизировать внешние возмущения. В отличие от ранее описанных подходов к механической стимуляции Стентора, это устройство позволяет изменять силу стимуляции под компьютерным управлением в ходе одного эксперимента, тем самым значительно увеличивая разнообразие входных последовательностей, которые могут быть применены. Понимание привыкания на уровне одной клетки поможет охарактеризовать парадигмы обучения, которые не зависят от сложной схемы.
Introduction
Обучение обычно связано со сложной нервной системой, но появляется все больше доказательств того, что жизнь на всех уровнях, вплоть до отдельных клеток, может демонстрировать разумное поведение. Как в естественных, так и в искусственных системах обучение — это адаптивное обновление параметров системы на основе новой информации1, а интеллект — это мера вычислительного процесса, облегчающая обучение2.
Stentor coeruleus является одноклеточным прудовым организмом, который проявляет привыкание, форму обучения, при которой поведенческая реакция уменьшается после повторного стимула3. Стентор сжимается в ответ на механическую стимуляцию3, которая является очевидной реакцией побега от водных хищников. Однако повторяющиеся возмущения с низкой силой вызывают привыкание, о чем свидетельствует прогрессирующее снижение вероятности сокращения3. Привычный стентор все еще сокращается после получения высокосиловой механической стимуляции4 или фотической стимуляции5. Эти наблюдения, которые согласуются с классическими критериями Томпсона и Спенсера для привыкания у животных6, убедительно свидетельствуют о том, что первоначальное снижение сократительной реакции связано с обучением, а не с усталостью или истощением АТФ. Как свободноживая клетка, Стентор может быть изучен без особого вмешательства со стороны окружающих клеток, как это было бы в случае с многоклеточной тканью. Несколько дополнительных особенностей делают Stentor пригодной для изучения обучения: его большой размер (1 мм), его количественный ответ привыкания3, простота инъекции и микроманипуляции7, полностью секвенированный геном8 и доступность инструментов РНК-интерференции (РНКи)9. Использование этого модельного организма для изучения клеточного обучения без мозга или нервной системы требует воспроизводимой процедуры стимуляции клеток Стентора и измерения ответа.
Здесь мы представляем метод количественной оценки привыкания Стентора с использованием микроконтроллерного устройства, связанного с платой, которое может доставлять механические импульсы с заданной силой и частотой, включая методы построения устройства и настройки эксперимента таким образом, чтобы минимизировать внешние возмущения (рисунок 1). Понимание привыкания на уровне одной клетки поможет охарактеризовать парадигмы обучения, которые не зависят от сложной схемы.
Рисунок 1: Настройка эксперимента по привыканию. Пластина Петри, содержащая Стентор , помещена поверх гибкой металлической линейки габуляционного устройства. Затем якорь устройства привыкания ударяется о металлическую линейку с заданной силой и частотой, производя стимулирующую волну через поле клеток. Камера USB-микроскопа записывает реакцию стентора на стимуляцию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Сводка рабочего процесса эксперимента по привыканию. На рисунке показаны основные этапы, связанные с изучением Стентора с помощью устройства привыкания. Рисунок был создан с BioRender.com. Адаптировано из «Технологической блок-схемы» BioRender.com (2022). Извлечено из https://app.biorender.com/biorender-templates. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наиболее важные шаги в протоколе касаются обеспечения того, чтобы стентор оставался в оптимальных условиях для возникновения схваток. Реакция на сокращение в анализе привыкания требует, чтобы стенторы были закреплены на поверхности с помощью их липкого удержания, поскольку они редко сжимаются, когда они свободно плавают. Однако нижняя поверхность 35-миллиметровой пластины Петри, используемой для экспериментов по привыканию, обычно не способствует анкеровке, если она не покрыта полиорнитином. Кроме того, стентор не может подвергаться какому-либо механическому возмущению в течение как минимум 2 ч до начала эксперимента по привыканию, потому что временная шкала забывания стентора составляет 2-6 ч3. Если Стентор получает механическую стимуляцию в течение 2 ч после начала эксперимента по привыканию, существует вероятность того, что эта предварительная стимуляция вызовет небольшой уровень привыкания до начала эксперимента, тем самым уменьшая вероятность сокращения после того, как устройство привыкания выдаст первый механический импульс. Наконец, на этапе анализа важно подсчитывать только количество стенторов , которые сокращаются после импульса, а не любые случайные спонтанные сокращения, которые происходят до доставки импульса, чтобы получить точное считывание доли клеток, которые сократились в ответ на механическую стимуляцию.
Протокол может быть легко модифицирован для изучения различных типов динамики привыкания путем изменения силы и частоты механических импульсов, подаваемых устройством привыкания. Это также дает возможность исследовать другие типы обучения, такие как сенсибилизация, которые могут происходить в Стенторе. Сам программный код платы микроконтроллера также может быть отрегулирован для подачи различных шаблонов механических нажатий на Stentor.
Одной из потенциальных проблем для устранения неполадок с помощью этого протокола является низкая частота закрепления стентора , которая может ограничить количество стенторов , которые можно наблюдать в эксперименте по привыканию. Частота анкеровки иногда снижается в культурах Стентора , которые недавно не были скормлены или загрязнены. Чтобы решить эту проблему, следует промыть свежую партию стентора , чтобы начать новую культуру и регулярно кормить их в соответствии с протоколом, описанным в Lin et al.10.
Этот протокол ограничен тем, что только одна пластина Stentor может быть проверена за один раз, что приводит к относительно низкой пропускной способности измерений. Кроме того, существующее программное обеспечение не позволяет автоматизировать анализ одноклеточных изображений. Таким образом, большинство полученных данных относятся к численности населения. Будущие модели устройства привыкания и инструментов анализа изображений могут способствовать высокопроизводительным экспериментам с одной ячейкой.
Привыкание в Стенторе было ранее изучено с использованием методов, описанных в Wood3, но этот новый протокол позволяет автоматизировать эксперименты. Автоматизация не только позволяет исследователю воспроизводимо доставлять механические импульсы заданной силы и частоты, но и облегчает долгосрочные эксперименты по привыканию, поскольку устройство можно оставить без присмотра в течение нескольких дней. Кроме того, использование шагового двигателя, а не соленоида, используемого в экспериментахВуда 3 , снижает риск размагничивания с течением времени, а также позволяет изменять силу стимула в течение одного эксперимента.
Изучение клеточной привыкания может выявить клинические идеи для таких состояний, как синдром дефицита внимания / гиперактивности (СДВГ) и синдром Туретта, при котором привыкание нарушено11. Механизмы привыкания стентора могут также открыть новые несинаптические парадигмы обучения, независимые от сложных клеточных схем. Наконец, понимание одноклеточного обучения может вдохновить методы перепрограммирования клеток в многоклеточных тканях – еще один потенциальный способ борьбы с болезнями.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Благодарим Татьяну Макушок за бесчисленные дискуссии об обучении Стентору . Эта работа финансировалась грантом NSF MCB-2012647 и грантом NIH R35 GM130327, а также премией I2CELL от Фонда Фурментен-Гильберта.
Materials
| 0.01% Poly-ornithine | Millipore Sigma | P4957 | Used to coat Petri plate |
| 35-mm Petri plate | Benz Microscope Optics Center Inc. | L331 | Contains Stentor during experiments |
| 6-well plate | StemCell Technologies | 38016 | Used to wash Stentor |
| Aluminum breadboard, 4" x 24" x 1/2" (x1) | Thorlabs | MB424 | Used to construct habituation device |
| Big easy driver stepper motor driver board (x1) | Sparkfun | ROB-12859 | Used to construct habituation device |
| Construction rail, 1" x 5'' (x2) | Newport | Newport CR-1 | Used to construct habituation device |
| Laptop | Apple Store | https://www.apple.com/macbook-air-m1/ | Connect laptop to USB microscope to visualize experiments |
| Large right-angle bracket (x1) | Thorlabs | AP90RL | Used to construct habituation device |
| Microcontroller board | Arduino | A000066 | Used to control habituation device |
| Nema 17 Stepper Motor Bipolar 59Ncm 2A 84oz.in 48mm 4-Lead | Stepperonline.com | 5-17HS19-2004S1 | Used to construct habituation device |
| Pasteurized spring water | Carolina | 132458 | Media for Stentor experiments |
| Right-angle bracket (x3) | Thorlabs | AP90 | Used to construct habituation device |
| Stemi 2000 stereo microscope | Zeiss | Used to visualize Stentor during wash steps | |
| Stentor coeruleus | Carolina | 131598 | These are the cells used for habituation experiments |
| USB microscope | Celestron | 44308 | Used to visualize and record experiments |
| Webcam recorder | Apple Store | https://apps.apple.com/us/app/webcam-recorder/id1508067444?mt=12 | Install this application to take videos of experiments |
Referencias
- Dussutour, A. Learning in single cell organisms. Biochemical and Biophysical Research Communications. 564, 92-102 (2021).
- Sternberg, R. J. Intelligence. Dialogues in Clinical Neuroscience. 14 (1), 19-27 (2012).
- Wood, D. C. Parametric studies of the response decrement produced by mechanical stimuli in the protozoan, Stentor coeruleus. Journal of Neurobiology. 1 (3), 345-360 (1969).
- Tang, S. K. Y., Marshall, W. F. Cell learning. Current Biology. 28 (20), 1180-1184 (2018).
- Wood, D. C. Stimulus specific habituation in a protozoan. Physiology and Behavior. 11 (3), 349-354 (1973).
- Thompson, R. F., Spencer, W. A. Habituation: A model phenomenon for the study of neuronal substrates of behavior. Psychological Review. 73 (1), 16-43 (1966).
- Slabodnick, M. M., Marshall, W. M. Stentor coeruleus. Current Biology. 24 (17), 783-784 (2014).
- Slabodnick, M. M., et al. The macronuclear genome of Stentor coeruleus reveals tiny introns in a giant cell. Current Biology. 27 (4), 569-575 (2017).
- Slabodnick, M. M., et al. The kinase regulator Mob1 acts as a patterning protein for Stentor morphogenesis. PLoS Biology. 12 (5), 1001861 (2014).
- Lin, A., Makushok, T., Diaz, U., Marshall, W. F. Methods for the study of regeneration in Stentor. Journal of Visualized Experiments. (136), e57759 (2018).
- McDiarmid, T. A., Bernardos, A. C., Rankin, C. H. Habituation is altered in neuropsychiatric disorders-A comprehensive review with recommendations for experimental design and analysis. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 80, 286-305 (2017).
