Stentor coeruleus'ta Alışkanlık Eğitimi
Summary
Stentor alışkanlığını, belirli bir kuvvet ve frekansta mekanik darbeler verebilen mikrodenetleyici kartına bağlı bir cihaz kullanarak ölçmek için bir yöntem sunuyoruz. Ayrıca, aparatı monte etmek ve deneyi dış karışıklıkları en aza indirecek şekilde kurmak için yöntemler de ekliyoruz.
Abstract
Öğrenme genellikle karmaşık bir sinir sistemi ile ilişkilidir, ancak tek hücrelere kadar her seviyedeki yaşamın akıllı davranışlar sergileyebileceğine dair kanıtlar artmaktadır. Hem doğal hem de yapay sistemlerde öğrenme, yeni bilgilere dayanan sistem parametrelerinin uyarlanabilir güncellenmesidir ve zeka, öğrenmeyi kolaylaştıran hesaplama sürecinin bir ölçüsüdür. Stentor coeruleus , tekrarlanan bir uyaranın ardından davranışsal bir tepkinin azaldığı bir öğrenme şekli olan alışkanlık sergileyen tek hücreli bir gölette yaşayan organizmadır. Stentor , sucul avcılardan belirgin bir kaçış tepkisi olan mekanik stimülasyona yanıt olarak büzülür. Bununla birlikte, tekrarlanan düşük kuvvet pertürbasyonları, kasılma olasılığında ilerleyici bir azalma ile gösterilen alışkanlığı indükler. Burada, belirli bir kuvvet ve frekansta mekanik darbeler verebilen mikrodenetleyici kartına bağlı bir cihaz kullanarak Stentor alışkanlığını ölçmek için bir yöntem sunuyoruz, buna cihazı oluşturma ve deneyi dış karışıklıkları en aza indirecek şekilde kurma yöntemleri de dahil. Stentor’u mekanik olarak uyarmak için daha önce açıklanan yaklaşımların aksine, bu cihaz stimülasyon kuvvetinin tek bir deney sırasında bilgisayar kontrolü altında değiştirilmesine izin verir, böylece uygulanabilecek giriş dizilerinin çeşitliliğini büyük ölçüde arttırır. Alışkanlığı tek bir hücre düzeyinde anlamak, karmaşık devrelerden bağımsız öğrenme paradigmalarını karakterize etmeye yardımcı olacaktır.
Introduction
Öğrenme genellikle karmaşık bir sinir sistemi ile ilişkilidir, ancak tek hücrelere kadar her seviyedeki yaşamın akıllı davranışlar sergileyebileceğine dair kanıtlar artmaktadır. Hem doğal hem de yapay sistemlerde öğrenme, yeni bilgilere dayanan sistem parametrelerinin uyarlanabilir güncellenmesidir1 ve zeka, öğrenmeyi kolaylaştıran hesaplama sürecinin bir ölçüsüdür2.
Stentor coeruleus , tekrarlanan bir uyaranın ardından davranışsal bir tepkinin azaldığı bir öğrenme şekli olan alışkanlık sergileyen tek hücreli bir gölette yaşayan organizmadır3. Stentor , sucul avcılardan belirgin bir kaçış tepkisi olan mekanik stimülasyon3’e yanıt olarak büzülür. Bununla birlikte, tekrarlanan düşük kuvvet pertürbasyonları, kasılma olasılığında ilerleyici bir azalma ile gösterilen alışkanlığı indükler3. Alışılmış Stentor, yüksek kuvvetli mekanik stimülasyon4 veya fotik stimülasyon 5 aldıktan sonra halabüzülür. Thompson ve Spencer’ın hayvanlarda alışkanlık için klasik kriterleri6 ile uyumlu olan bu gözlemler, orijinal kasılma yanıtı azalmasının yorgunluk veya ATP tükenmesinden ziyade öğrenmeden kaynaklandığını kuvvetle göstermektedir. Serbest yaşayan bir hücre olarak Stentor , çok hücreli bir dokuda olduğu gibi, çevredeki hücrelerden çok fazla müdahale olmadan incelenebilir. Birkaç ek özellik, Stentor’u öğrenmeyi incelemek için izlenebilir bir sistem haline getirir: büyük boyutu (1 mm), ölçülebilir alışkanlık yanıtı3, enjeksiyon ve mikromanipülasyon kolaylığı7, tam sıralı genom8 ve RNA girişim (RNAi) araçlarının mevcudiyeti9. Bu model organizmayı beyin veya sinir sistemi olmadan hücre öğrenimini keşfetmek için kullanmak, Stentor hücrelerini uyarmak ve yanıtı ölçmek için tekrarlanabilir bir prosedür gerektirir.
Burada, belirli bir kuvvet ve frekansta mekanik darbeler verebilen mikrodenetleyici kartına bağlı bir cihaz kullanarak Stentor alışkanlığını ölçmek için, aparatı oluşturma ve deneyi dış karışıklıkları en aza indirecek şekilde kurma yöntemleri de dahil olmak üzere bir yöntem sunuyoruz (Şekil 1). Alışkanlığı tek bir hücre düzeyinde anlamak, karmaşık devrelerden bağımsız öğrenme paradigmalarını karakterize etmeye yardımcı olacaktır.
Şekil 1: Alışkanlık deneyi kurulumu. Stentor içeren Petri plakası, alışkanlık cihazının esnek metal cetvelinin üzerine yerleştirilir. Alışkanlık cihazının armatürü daha sonra metal cetveli belirli bir kuvvet ve frekansta vurur ve hücre alanı boyunca bir uyaran dalgası üretir. USB mikroskop kamerası, Stentor’un stimülasyona verdiği tepkileri kaydeder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Alışkanlık denemesi iş akışının özeti. Şekil, alışkanlık cihazını kullanarak Stentor’u incelemede yer alan temel adımları göstermektedir. Figür BioRender.com ile yaratıldı. BioRender.com (2022) tarafından “Süreç Akış Şeması” ndan uyarlanmıştır. https://app.biorender.com/biorender-templates’dan alındı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokoldeki en kritik adımlar, Stentor’un kasılmaların gerçekleşmesi için en uygun koşullarda kalmasını sağlamakla ilgilidir. Alışkanlık tahlilindeki kasılma tepkisi, Stentorların yapışkan tutuşlarını kullanarak bir yüzeye sabitlenmelerini gerektirir, çünkü serbestçe yüzerken nadiren büzülürler. Bununla birlikte, alışkanlık deneyleri için kullanılan 35 mm’lik Petri plakasının alt yüzeyi, poli-ornitin ile kaplanmadığı sürece tipik olarak ankraj için elverişli değildir. Ayrıca, Stentor alışkanlık deneyinin başlamasından en az 2 saat önce herhangi bir mekanik bozulmaya maruz bırakılamaz, çünkü Stentor unutma zaman çizelgesi 2-6 saat3’tür. Stentor, alışkanlık deneyi başlangıç zamanından sonraki 2 saat içinde mekanik stimülasyon alırsa, bu önceki stimülasyonun deneyden önce hafif bir alışkanlık seviyesine neden olma olasılığı vardır, böylece alışkanlık cihazı ilk mekanik darbeyi verdikten sonra büzülme olasılığını azaltır. Son olarak, analiz aşamasında, mekanik stimülasyona yanıt olarak büzülen hücrelerin fraksiyonunun doğru bir şekilde okunmasını sağlamak için nabız doğumundan önce meydana gelen tesadüfi spontan kasılmalardan ziyade, sadece bir nabızdan sonra büzülen Stentor sayısını saymak önemlidir.
Protokol, alışkanlık cihazı tarafından verilen mekanik darbelerin kuvvetini ve frekansını değiştirerek farklı alışkanlık dinamiklerini incelemek için kolayca değiştirilebilir. Bu aynı zamanda Stentor’da meydana gelebilecek duyarlılaştırma gibi diğer öğrenme türlerini keşfetme fırsatı da sağlar. Mikrodenetleyici kartı program kodunun kendisi, Stentor’a farklı mekanik musluk desenleri iletmek için de ayarlanabilir.
Bu protokolle giderilecek potansiyel bir sorun, alışkanlık deneyinde gözlemlenebilecek Stentor sayısını sınırlayabilecek düşük Stentor ankraj sıklığıdır. Yakın zamanda beslenmemiş veya kontamine olmuş Stentor kültürlerinde ankraj sıklığı bazen azalır. Bu sorunu çözmek için, yeni bir kültür başlatmak için taze bir Stentor partisi yıkanmalı ve Lin ve ark.10’da açıklanan protokole göre düzenli olarak beslenmelidir.
Bu protokol, bir seferde yalnızca tek bir Stentor plakasının test edilebilmesi ve nispeten düşük verimli ölçümlerle sonuçlanması nedeniyle sınırlıdır. Ayrıca, mevcut yazılım tek hücreli görüntü analizinin otomasyonuna izin vermemektedir. Bu nedenle, elde edilen verilerin çoğu nüfus düzeyinde. Alışkanlık cihazının ve görüntü analiz araçlarının gelecekteki modelleri, yüksek verimli tek hücreli deneyleri kolaylaştırabilir.
Stentor’daki alışkanlık daha önce Wood3 tarafından açıklanan yöntemler kullanılarak incelenmişti, ancak bu yeni protokol deneylerin otomatikleştirilmesine izin veriyor. Otomasyon, araştırmacının yalnızca belirli bir kuvvet ve frekanstaki mekanik darbeleri yeniden üretilebilir bir şekilde teslim etmesine izin vermekle kalmaz, aynı zamanda cihaz günlerce gözetimsiz olarak çalışır durumda bırakılabildiğinden, uzun vadeli alışkanlık deneylerini de kolaylaştırır. Ayrıca, Wood’un deneylerinde kullanılan solenoid yerine bir step motor kullanmak3, zamanla manyetiksizleşme riskini azaltır ve ayrıca uyaranın gücünün tek bir deney sırasında değiştirilmesine izin verir.
Hücresel alışkanlığın incelenmesi, dikkat eksikliği / hiperaktivite bozukluğu (DEHB) ve alışkanlığın bozulduğu Tourette sendromu gibi durumlar için klinik içgörüleri ortaya çıkarabilir11. Stentor alışkanlık mekanizmaları, karmaşık hücresel devreden bağımsız yeni sinaptik olmayan öğrenme paradigmalarını da ortaya çıkarabilir. Son olarak, tek hücreli öğrenme hakkındaki bilgiler, çok hücreli dokulardaki hücreleri yeniden programlamak için yöntemlere ilham verebilir – hastalıklarla savaşmak için başka bir potansiyel yol.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tatyana Makushok’a Stentor öğrenimi hakkında sayısız tartışma için teşekkür ederiz. Bu çalışma, NSF hibesi MCB-2012647 ve NIH hibesi R35 GM130327 tarafından ve ayrıca Fourmentin-Guilbert Vakfı’ndan I2CELL ödülü ile finanse edildi.
Materials
| 0.01% Poly-ornithine | Millipore Sigma | P4957 | Used to coat Petri plate |
| 35-mm Petri plate | Benz Microscope Optics Center Inc. | L331 | Contains Stentor during experiments |
| 6-well plate | StemCell Technologies | 38016 | Used to wash Stentor |
| Aluminum breadboard, 4" x 24" x 1/2" (x1) | Thorlabs | MB424 | Used to construct habituation device |
| Big easy driver stepper motor driver board (x1) | Sparkfun | ROB-12859 | Used to construct habituation device |
| Construction rail, 1" x 5'' (x2) | Newport | Newport CR-1 | Used to construct habituation device |
| Laptop | Apple Store | https://www.apple.com/macbook-air-m1/ | Connect laptop to USB microscope to visualize experiments |
| Large right-angle bracket (x1) | Thorlabs | AP90RL | Used to construct habituation device |
| Microcontroller board | Arduino | A000066 | Used to control habituation device |
| Nema 17 Stepper Motor Bipolar 59Ncm 2A 84oz.in 48mm 4-Lead | Stepperonline.com | 5-17HS19-2004S1 | Used to construct habituation device |
| Pasteurized spring water | Carolina | 132458 | Media for Stentor experiments |
| Right-angle bracket (x3) | Thorlabs | AP90 | Used to construct habituation device |
| Stemi 2000 stereo microscope | Zeiss | Used to visualize Stentor during wash steps | |
| Stentor coeruleus | Carolina | 131598 | These are the cells used for habituation experiments |
| USB microscope | Celestron | 44308 | Used to visualize and record experiments |
| Webcam recorder | Apple Store | https://apps.apple.com/us/app/webcam-recorder/id1508067444?mt=12 | Install this application to take videos of experiments |
Referencias
- Dussutour, A. Learning in single cell organisms. Biochemical and Biophysical Research Communications. 564, 92-102 (2021).
- Sternberg, R. J. Intelligence. Dialogues in Clinical Neuroscience. 14 (1), 19-27 (2012).
- Wood, D. C. Parametric studies of the response decrement produced by mechanical stimuli in the protozoan, Stentor coeruleus. Journal of Neurobiology. 1 (3), 345-360 (1969).
- Tang, S. K. Y., Marshall, W. F. Cell learning. Current Biology. 28 (20), 1180-1184 (2018).
- Wood, D. C. Stimulus specific habituation in a protozoan. Physiology and Behavior. 11 (3), 349-354 (1973).
- Thompson, R. F., Spencer, W. A. Habituation: A model phenomenon for the study of neuronal substrates of behavior. Psychological Review. 73 (1), 16-43 (1966).
- Slabodnick, M. M., Marshall, W. M. Stentor coeruleus. Current Biology. 24 (17), 783-784 (2014).
- Slabodnick, M. M., et al. The macronuclear genome of Stentor coeruleus reveals tiny introns in a giant cell. Current Biology. 27 (4), 569-575 (2017).
- Slabodnick, M. M., et al. The kinase regulator Mob1 acts as a patterning protein for Stentor morphogenesis. PLoS Biology. 12 (5), 1001861 (2014).
- Lin, A., Makushok, T., Diaz, U., Marshall, W. F. Methods for the study of regeneration in Stentor. Journal of Visualized Experiments. (136), e57759 (2018).
- McDiarmid, T. A., Bernardos, A. C., Rankin, C. H. Habituation is altered in neuropsychiatric disorders-A comprehensive review with recommendations for experimental design and analysis. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 80, 286-305 (2017).
