Summary

Saggio di pulldown accoppiato con co-espressione in cellule batteriche come strumento efficiente in termini di tempo per testare interazioni proteina-proteina impegnative

Published: December 23, 2022
doi:

Summary

Qui, descriviamo un metodo per la co-espressione batterica di proteine marcate differenzialmente utilizzando un insieme di vettori compatibili, seguito dalle tecniche convenzionali di pulldown per studiare complessi proteici che non possono assemblarsi in vitro.

Abstract

Il pulldown è un test di interazione proteina-proteina facile e ampiamente utilizzato. Tuttavia, ha limitazioni nello studio di complessi proteici che non si assemblano efficacemente in vitro. Tali complessi possono richiedere l’assemblaggio co-traduzionale e la presenza di chaperoni molecolari; o formano oligomeri stabili che non possono dissociarsi e riassociarsi in vitro o sono instabili senza un partner legante. Per superare questi problemi, è possibile utilizzare un metodo basato sulla co-espressione batterica di proteine marcate differenzialmente utilizzando un insieme di vettori compatibili seguiti dalle tecniche convenzionali di pulldown. Il flusso di lavoro è più efficiente in termini di tempo rispetto al pulldown tradizionale perché manca delle lunghe fasi di purificazione separata delle proteine interagenti e della loro successiva incubazione. Un altro vantaggio è una maggiore riproducibilità dovuta a un numero significativamente inferiore di passaggi e un periodo di tempo più breve in cui le proteine che esistono all’interno dell’ambiente in vitro sono esposte alla proteolisi e all’ossidazione. Il metodo è stato applicato con successo per studiare una serie di interazioni proteina-proteina quando altre tecniche in vitro sono risultate inadatte. Il metodo può essere utilizzato per testare in batch le interazioni proteina-proteina. Risultati rappresentativi sono mostrati per studi di interazioni tra dominio BTB e proteine intrinsecamente disordinate, e di eterodimeri di domini associati a dita di zinco.

Introduction

Il pulldown convenzionale è ampiamente utilizzato per studiare le interazioni proteina-proteina1. Tuttavia, le proteine purificate spesso non interagiscono efficacemente in vitro2,3, e alcune di esse sono insolubili senza il loro partner legante 4,5. Tali proteine potrebbero richiedere l’assemblaggio co-traduzionale o la presenza di chaperoni molecolari 5,6,7,8,9. Un’altra limitazione del pulldown convenzionale è la verifica della possibile attività di eteromultimerizzazione tra domini che possono esistere come omo-oligomeri stabili assemblati co-traduzionalmente 8,10, poiché molti di essi non possono dissociarsi e riassociarsi in vitro durante il tempo di incubazione. La co-espressione è risultata utile per superare tali problemi 3,11. La co-espressione utilizzando vettori compatibili nei batteri è stata utilizzata con successo per purificare grandi complessi macromolecolari multi-subunità, incluso il complesso repressivo policomb PRC212, il modulo testa del mediatore della RNA polimerasi II13, il batteriofago T4 baseplate 14, il modulo di deubiquitinylasi del complesso SAGA 15,16 e la ferritina 17. Le origini di replica comunemente usate per la co-espressione sono ColE1, p15A18, CloDF1319 e RSF20. Nel sistema di espressione Duet disponibile in commercio, queste origini sono combinate con diversi geni di resistenza agli antibiotici e convenienti siti di clonazione multipli per produrre vettori policistroni, consentendo l’espressione di un massimo di otto proteine. Queste origini hanno numeri di copie diversi e possono essere utilizzate in varie combinazioni per raggiungere livelli di espressione equilibrati delle proteine bersaglio21. Per testare le interazioni proteina-proteina, vengono utilizzati vari tag di affinità; i più comuni sono la 6xIstidina, la glutatione-S-transferasi (GST) e la proteina legante il maltosio (MBP), ognuno dei quali ha un’affinità specifica con la resina corrispondente. GST e MBP migliorano anche la solubilità e la stabilità delle proteine marcate22.

Sono stati inoltre sviluppati numerosi metodi che coinvolgono la co-espressione proteica nelle cellule eucariotiche, il più importante dei quali è il saggio a due ibridi di lievito (Y2H)23. Il test Y2H è economico, facile e consente di testare più interazioni; Tuttavia, il completamento del flusso di lavoro richiede più di 1 settimana. Esistono anche alcuni saggi basati su cellule di mammifero meno frequentemente utilizzati, ad esempio il saggio fluorescente a due ibridi (F2H)24 e il saggio di interazione proteina-proteina (CAPPIA)25. Il test F2H è relativamente veloce, consentendo di osservare le interazioni proteiche nel loro ambiente cellulare nativo, ma comporta l’uso di costose apparecchiature di imaging. Tutti questi metodi hanno un vantaggio rispetto all’espressione procariotica che fornisce la traduzione eucariotica nativa e l’ambiente di piegatura; Tuttavia, rilevano l’interazione indirettamente, sia per attivazione trascrizionale che per trasferimento di energia fluorescente, che spesso produce artefatti. Inoltre, le cellule eucariotiche possono contenere altri partner di interazione di proteine di interesse, che possono interferire con il test delle interazioni binarie tra proteine di eucarioti superiori.

Il presente studio descrive un metodo per la co-espressione batterica di proteine marcate in modo differenziale seguito da tecniche convenzionali di pulldown. Il metodo consente di studiare le interazioni tra proteine bersaglio che richiedono co-espressione. È più efficiente in termini di tempo rispetto al pulldown tradizionale, consentendo il test in batch di più obiettivi, il che lo rende vantaggioso nella maggior parte dei casi. La co-espressione usando vettori compatibili è più conveniente della co-espressione policistronica poiché non richiede una laboriosa fase di clonazione.

Protocol

La rappresentazione schematica del flusso di lavoro del metodo è illustrata nella Figura 1. 1. Co-trasformazione di E. coli Preparare vettori di espressione per proteine bersaglio utilizzando metodi di clonazione standard.NOTA: Tipicamente, un buon punto di partenza è quello di utilizzare vettori pGEX/pMAL convenzionali che portano un gene di resistenza all’ampicillina e l’origine ColE1 per l’espressione di proteine marcat…

Representative Results

Il metodo descritto è stato utilizzato di routine con molti obiettivi diversi. Presentati qui sono alcuni risultati rappresentativi che probabilmente non possono essere ottenuti utilizzando tecniche di pulldown convenzionali. Il primo è lo studio della dimerizzazione specifica ZAD (Zinc-finger-associated domain)11. Gli ZAD formano dimeri stabili e specifici, con eterodimeri possibili solo tra domini strettamente correlati all’interno di gruppi paraloghi. I dimeri formati da questi domini sono st…

Discussion

Il metodo descritto consente di testare le interazioni proteina-proteina che non possono essere assemblate in modo efficiente in vitro e richiedono la co-espressione. Il metodo è uno dei pochi approcci adatti per lo studio delle proteine eterodimerizzanti, che sono anche in grado di omodimerizzare poiché, se purificate separatamente, tali proteine formano omodimeri stabili che il più delle volte non possono dissociarsi e riassociarsi durante l’esperimento 3,11<sup class="xre…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dai progetti della Russian Science Foundation 19-74-30026 (sviluppo e convalida del metodo) e 19-74-10099 (saggi di interazione proteina-proteina); e dal Ministero della Scienza e dell’Istruzione Superiore della Federazione Russa-grant 075-15-2019-1661 (analisi delle interazioni rappresentative proteina-proteina).

Materials

8-ELEMENT probe Sonics 630-0586 The high throughput 8-element sonicator probes
Agar AppliChem A0949
Amylose resin New England Biolabs E8021 Resin for purification of MBP-tagged proteins
Antibiotics AppliChem A4789 (kanamycin); A0839 (ampicillin)
Beta-mercaptoethanol AppliChem A1108
BL21(DE3)  Novagen 69450-M
CaCl2 AppliChem A4689
Centrifuge Eppendorf 5415R (Z605212)
Glutathione AppliChem A9782
Glutathione agarose Pierce 16100 Resin for purification of GST-tagged proteins
Glycerol AppliChem A2926
HEPES  AppliChem A3724
HisPur Ni-NTA Superflow Agarose Thermo Scientific 25214 Resin for purification of 6xHis-tagged proteins
Imidazole AppliChem A1378
IPTG AppliChem A4773
KCl AppliChem A2939
LB AppliChem 414753
Maltose AppliChem A3891
MOPS AppliChem A2947
NaCl AppliChem A2942
NP40 Roche 11754599001
pACYCDuet-1 Sigma-Aldrich 71147 Vector for co-expression of proteins with p15A replication origin
pCDFDuet-1 Sigma-Aldrich 71340 Vector for co-expression of proteins with CloDF13 replication origin
PMSF AppliChem A0999
Protease Inhibitor Cocktail VII Calbiochem 539138 Protease Inhibitor Cocktail
pRSFDuet-1 Sigma-Aldrich 71341 Vector for co-expression of proteins with RSF replication origin
SDS  AppliChem A2263
Tris  AppliChem A2264
VC505 sonicator Sonics CV334 Ultrasonic liquid processor
ZnCl2 AppliChem A6285

Referencias

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Citar este artículo
Bonchuk, A., Zolotarev, N., Balagurov, K., Arkova, O., Georgiev, P. Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions. J. Vis. Exp. (190), e64541, doi:10.3791/64541 (2022).

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