Анализ вытягивания в сочетании с коэкспрессией в клетках бактерий как эффективный по времени инструмент для тестирования сложных белково-белковых взаимодействий

Обычный вытягивание широко используется для изучения белково-белковых взаимодействий¹. Однако очищенные белки часто не взаимодействуют эффективно in vitro^2,3, а некоторые из них нерастворимы без своего партнера по связыванию ^4,5. Такие белки могут потребовать котрансляционной сборки или присутствия молекулярных шаперонов 5,6,7,8,9. Другим ограничением обычного вытягивания является тестирование возможной гетеромультимеризационной активности между доменами, которые могут существовать в виде стабильных гомоолигомеров, собранных котрансляционно ^8,10, поскольку многие из них не могут диссоциировать и повторно ассоциировать in vitro во время инкубации. Было обнаружено, что совместное выражение полезно для преодоления таких проблем ^3,11. Коэкспрессия с использованием совместимых векторов в бактериях была успешно использована для очистки больших мультисубъединичных макромолекулярных комплексов, включая поликомбный репрессивный комплекс PRC2¹², РНК-полимеразу II медиаторный головной модуль¹³, базовую пластину^{бактериофага Т4 14}, комплекс SAGA деубиквитинилазный модуль ^15,16 и ферритин¹⁷. Источниками репликации, обычно используемыми для совместной экспрессии, являются ColE1, p15A¹⁸, CloDF13¹⁹ и RSF²⁰. В коммерчески доступной системе экспрессии Duet эти источники сочетаются с различными генами устойчивости к антибиотикам и удобными несколькими сайтами клонирования для получения полицистронных векторов, позволяющих экспрессировать до восьми белков. Эти источники имеют разное количество копий и могут использоваться в различных комбинациях для достижения сбалансированных уровней экспрессии целевых белков²¹. Для проверки белок-белковых взаимодействий используются различные аффинные метки; наиболее распространенными являются 6xгистидин, глутатион-S-трансфераза (GST) и мальтозосвязывающий белок (MBP), каждый из которых имеет специфическое сродство к соответствующей смоле. GST и MBP также повышают растворимость и стабильность меченых белков²².

Также был разработан ряд методов, включающих коэкспрессию белка в эукариотических клетках, наиболее известным из которых является двухгибридный анализ дрожжей (Y2H)²³. Анализ Y2H дешев, прост и позволяет тестировать несколько взаимодействий; Однако его рабочий процесс занимает более 1 недели. Существует также несколько менее часто используемых анализов на основе клеток млекопитающих, например, флуоресцентный двухгибридный анализ (F2H)²⁴ и анализ белково-белкового взаимодействия клеточного массива (CAPPIA)²⁵. Анализ F2H является относительно быстрым, что позволяет наблюдать белковые взаимодействия в их родной клеточной среде, но требует использования дорогостоящего оборудования для визуализации. Все эти методы имеют преимущество перед прокариотической экспрессией, обеспечивая нативную эукариотическую среду трансляции и складывания; Однако они обнаруживают взаимодействие косвенно, либо путем активации транскрипции, либо путем флуоресцентного переноса энергии, что часто приводит к артефактам. Кроме того, эукариотические клетки могут содержать других партнеров по взаимодействию интересующих белков, что может мешать тестированию бинарных взаимодействий между белками высших эукариот.

В настоящем исследовании описывается метод бактериальной коэкспрессии дифференциально меченных белков с последующим использованием традиционных методов вытягивания. Метод позволяет изучать взаимодействия между белками-мишенями, требующими коэкспрессии. Он более эффективен по времени по сравнению с традиционным вытягиванием, позволяя проводить пакетное тестирование нескольких целей, что делает его выгодным в большинстве случаев. Коэкспрессия с использованием совместимых векторов более удобна, чем полицистронная коэкспрессия, поскольку не требует трудоемкого этапа клонирования.