細菌細胞での共発現と組み合わせたプルダウンアッセイは、困難なタンパク質間相互作用をテストするための時間効率の良いツールとして

従来のプルダウンは、タンパク質間相互作用の研究に広く使用されています¹。しかしながら、精製されたタンパク質は、インビトロで効果的に相互作用しないことが多く^2,3、それらのいくつかは、それらの結合パートナーなしでは不溶性である^4,5。そのようなタンパク質は、共翻訳アセンブリまたは分子シャペロンの存在を必要とする^{かもしれない}5,6,7,8,9。従来のプルダウンの別の制限は、共翻訳的に組み立てられた安定なホモオリゴマーとして存在し得るドメイン間のヘテロ多量体化活性の試験です^8,10、それらの多くはインビトロで解離および再会合することができないため、インキュベーション時間中に。共発現は、このような問題を克服するのに有用であることがわかった^3、11。細菌における適合ベクターを用いた共発現は、ポリコーム抑制複合体PRC2 12、RNAポリメラーゼIIメディエーターヘッドモジュール¹³、バクテリオファージT4ベースプレート14、SAGA複合体デユビキチニラーゼモジュール15、16^、およびフェリチン¹⁷を含む大きなマルチサブユニット高分子複合体の精製に成功しました。共発現に一般的に使用される複製起点は、ColE1、p15A¹⁸、CloDF13¹⁹、およびRSF²⁰です。市販のDuet発現システムでは、これらの起源を異なる抗生物質耐性遺伝子および便利な複数のクローニング部位と組み合わせてポリシストロニックベクターを作製し、最大8つのタンパク質の発現を可能にします。これらの起源は異なるコピー数を有し、標的タンパク質のバランスの取れた発現レベルを達成するために様々な組み合わせで使用することができる²¹。タンパク質間相互作用をテストするために、さまざまな親和性タグが使用されます。最も一般的なのは、6xヒスチジン、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)、およびマルトース結合タンパク質(MBP)であり、それぞれが対応する樹脂に特異的な親和性を持っています。GSTおよびMBPはまた、タグ付きタンパク質の溶解性および安定性を高める²²。

真核細胞におけるタンパク質共発現を含む多くの方法も開発されており、その中で最も顕著なのは酵母ツーハイブリッドアッセイ(Y2H)²³です。Y2Hアッセイは安価で簡単で、複数の相互作用のテストが可能です。ただし、ワークフローが完了するまでに1週間以上かかります。また、蛍光ツーハイブリッドアッセイ(F2H)²⁴ や細胞アレイタンパク質間相互作用アッセイ(CAPPIA)²⁵など、あまり使用頻度の低い哺乳類細胞ベースのアッセイもいくつかあります。F2Hアッセイは比較的高速であり、天然の細胞環境でタンパク質相互作用を観察することができますが、高価なイメージング機器を使用する必要があります。これらの方法はすべて、ネイティブの真核生物の翻訳および折り畳み環境を提供する原核生物発現よりも優れています。しかし、それらは、転写活性化または蛍光エネルギー伝達のいずれかによって間接的に相互作用を検出し、しばしばアーティファクトを生成します。また、真核細胞は、目的のタンパク質の他の相互作用パートナーを含む可能性があり、これは、高等真核生物のタンパク質間の二元相互作用の試験を妨げる可能性がある。

本研究では、従来のプルダウン技術に従った、差次的にタグ付けされたタンパク質の細菌共発現の方法について説明しています。この方法では、共発現を必要とする標的タンパク質間の相互作用を研究することができます。従来のプルダウンに比べて時間効率が高く、複数のターゲットのバッチテストが可能で、ほとんどの場合に有利です。適合ベクターを用いた共発現は、面倒なクローニング工程を必要としないため、ポリシストロニック共発現よりも簡便である。