Summary

Ensaio Pulldown Juntamente com Co-Expressão em Células de Bactérias como uma Ferramenta Eficiente em Tempo para Testar Interações Desafiadoras Proteína-Proteína

Published: December 23, 2022
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Summary

Aqui, descrevemos um método para a co-expressão bacteriana de proteínas diferencialmente marcadas usando um conjunto de vetores compatíveis, seguido pelas técnicas convencionais de pulldown para estudar complexos proteicos que não podem se montar in vitro.

Abstract

Pulldown é um ensaio de interação proteína-proteína fácil e amplamente utilizado. No entanto, tem limitações no estudo de complexos proteicos que não se reúnem efetivamente in vitro. Tais complexos podem exigir montagem co-translacional e a presença de chaperonas moleculares; ou formam oligômeros estáveis que não podem dissociar e reassociar in vitro ou são instáveis sem um parceiro de ligação. Para superar esses problemas, é possível utilizar um método baseado na co-expressão bacteriana de proteínas diferencialmente marcadas utilizando um conjunto de vetores compatíveis seguidos pelas técnicas convencionais de pulldown. O fluxo de trabalho é mais eficiente em termos de tempo em comparação com o pulldown tradicional, porque não possui as etapas demoradas de purificação separada de proteínas que interagem e sua incubação seguinte. Outra vantagem é uma maior reprodutibilidade devido a um número significativamente menor de etapas e um menor período de tempo em que as proteínas que existem dentro do ambiente in vitro são expostas à proteólise e oxidação. O método foi aplicado com sucesso para estudar uma série de interações proteína-proteína quando outras técnicas in vitro foram consideradas inadequadas. O método pode ser usado para testar em lote as interações proteína-proteína. Resultados representativos são mostrados para estudos de interações entre o domínio BTB e proteínas intrinsecamente desordenadas, e de heterodímeros de domínios associados ao dedo de zinco.

Introduction

O pulldown convencional é amplamente utilizado para estudar as interações proteína-proteína1. No entanto, as proteínas purificadas muitas vezes não interagem efetivamente in vitro2,3, e algumas delas são insolúveis sem seu parceiro de ligação 4,5. Tais proteínas podem necessitar de montagem co-translacional ou da presença de chaperonas moleculares 5,6,7,8,9. Outra limitação do pulldown convencional é o teste de possível atividade de heteromultimerização entre domínios que podem existir como homooligômeros estáveis montados co-translacionalmente 8,10, pois muitos deles não conseguem dissociar e reassociar in vitro durante o tempo de incubação. A co-expressão mostrou-se útil na superação de tais problemas 3,11. A co-expressão usando vetores compatíveis em bactérias foi utilizada com sucesso para purificar grandes complexos macromoleculares multi-subunidades, incluindo o complexo repressivo policomb PRC212, o módulo de cabeça mediador da RNA polimerase II13, a placa de base do bacteriófago T4 14, o módulo 15,16 da desubiquitinilase do complexo SAGA 15,16 e a ferritina 17. As origens de replicação comumente usadas para coexpressão são ColE1, p15A18, CloDF1319 e RSF20. No sistema de expressão Duet comercialmente disponível, essas origens são combinadas com diferentes genes de resistência a antibióticos e convenientes múltiplos locais de clonagem para produzir vetores policistrônicos, permitindo a expressão de até oito proteínas. Essas origens têm diferentes números de cópia e podem ser usadas em combinações variadas para alcançar níveis de expressão equilibrados de proteínas-alvo21. Para testar as interações proteína-proteína, várias tags de afinidade são usadas; os mais comuns são 6xHistidina, glutationa-S-transferase (GST) e proteína ligadora de maltose (MBP), cada uma das quais tem uma afinidade específica com a resina correspondente. GST e MBP também aumentam a solubilidade e a estabilidade das proteínas marcadas22.

Vários métodos envolvendo a co-expressão de proteínas em células eucarióticas também foram desenvolvidos, o mais proeminente dos quais é o ensaio híbrido de levedura dupla (Y2H)23. O ensaio Y2H é barato, fácil e permite o teste de múltiplas interações; no entanto, seu fluxo de trabalho leva mais de 1 semana para ser concluído. Há também alguns ensaios baseados em células de mamíferos menos utilizados, por exemplo, ensaio fluorescente de dois híbridos (F2H)24 e ensaio de interação proteína-proteína de matriz celular (CAPPIA)25. O ensaio F2H é relativamente rápido, permitindo observar interações proteicas em seu ambiente celular nativo, mas envolve o uso de equipamentos de imagem caros. Todos esses métodos têm uma vantagem sobre a expressão procariótica, proporcionando a tradução eucariótica nativa e o ambiente de dobramento; no entanto, eles detectam a interação indiretamente, seja por ativação transcricional ou por transferência de energia fluorescente, que muitas vezes produz artefatos. Além disso, as células eucarióticas podem conter outros parceiros de interação de proteínas de interesse, o que pode interferir no teste de interações binárias entre proteínas de eucariotas superiores.

O presente estudo descreve um método para a co-expressão bacteriana de proteínas diferencialmente marcadas seguido de técnicas convencionais de pulldown. O método permite estudar as interações entre proteínas-alvo que requerem co-expressão. É mais eficiente em termos de tempo em comparação com o pulldown tradicional, permitindo o teste em lote de vários alvos, o que o torna vantajoso na maioria dos casos. A co-expressão usando vetores compatíveis é mais conveniente do que a co-expressão policistrônica, uma vez que não requer uma etapa de clonagem trabalhosa.

Protocol

A representação esquemática do fluxo de trabalho do método é mostrada na Figura 1. 1. Co-transformação de E. coli Preparar vetores de expressão para proteínas-alvo usando métodos de clonagem padrão.NOTA: Normalmente, um bom ponto de partida é usar vetores pGEX/pMAL convencionais com um gene de resistência à ampicilina e origem ColE1 para a expressão de proteínas marcadas com GST/MBP e um vetor compatível com…

Representative Results

O método descrito foi utilizado rotineiramente com muitos alvos diferentes. Apresentamos aqui alguns resultados representativos que provavelmente não podem ser obtidos usando técnicas convencionais de pulldown. O primeiro é o estudo da dimerização específica do ZAD (domínio associado ao dedo do zinco)11. As ZADs formam dímeros estáveis e específicos, com heterodímeros possíveis apenas entre domínios intimamente relacionados dentro de grupos parálogos. Os dímeros formados por esses …

Discussion

O método descrito permite o teste de interações proteína-proteína que não podem ser eficientemente montadas in vitro e requerem co-expressão. O método é uma das poucas abordagens adequadas para o estudo de proteínas heterodimerizantes, que também são capazes de homodimerização, uma vez que, quando purificadas separadamente, essas proteínas formam homodímeros estáveis que, na maioria das vezes, não conseguem dissociar e reassociar durante o experimento 3,11<sup…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelos projetos da Fundação Russa de Ciência 19-74-30026 (desenvolvimento e validação de métodos) e 19-74-10099 (ensaios de interação proteína-proteína); e pelo Ministério da Ciência e Ensino Superior da Federação Russa – concessão 075-15-2019-1661 (análise de interações representativas proteína-proteína).

Materials

8-ELEMENT probe Sonics 630-0586 The high throughput 8-element sonicator probes
Agar AppliChem A0949
Amylose resin New England Biolabs E8021 Resin for purification of MBP-tagged proteins
Antibiotics AppliChem A4789 (kanamycin); A0839 (ampicillin)
Beta-mercaptoethanol AppliChem A1108
BL21(DE3)  Novagen 69450-M
CaCl2 AppliChem A4689
Centrifuge Eppendorf 5415R (Z605212)
Glutathione AppliChem A9782
Glutathione agarose Pierce 16100 Resin for purification of GST-tagged proteins
Glycerol AppliChem A2926
HEPES  AppliChem A3724
HisPur Ni-NTA Superflow Agarose Thermo Scientific 25214 Resin for purification of 6xHis-tagged proteins
Imidazole AppliChem A1378
IPTG AppliChem A4773
KCl AppliChem A2939
LB AppliChem 414753
Maltose AppliChem A3891
MOPS AppliChem A2947
NaCl AppliChem A2942
NP40 Roche 11754599001
pACYCDuet-1 Sigma-Aldrich 71147 Vector for co-expression of proteins with p15A replication origin
pCDFDuet-1 Sigma-Aldrich 71340 Vector for co-expression of proteins with CloDF13 replication origin
PMSF AppliChem A0999
Protease Inhibitor Cocktail VII Calbiochem 539138 Protease Inhibitor Cocktail
pRSFDuet-1 Sigma-Aldrich 71341 Vector for co-expression of proteins with RSF replication origin
SDS  AppliChem A2263
Tris  AppliChem A2264
VC505 sonicator Sonics CV334 Ultrasonic liquid processor
ZnCl2 AppliChem A6285

Referencias

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Bonchuk, A., Zolotarev, N., Balagurov, K., Arkova, O., Georgiev, P. Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions. J. Vis. Exp. (190), e64541, doi:10.3791/64541 (2022).

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