下拉测定与细菌细胞共表达相结合，作为测试具有挑战性的蛋白质-蛋白质相互作用的省时工具

常规下拉广泛用于研究蛋白质-蛋白质相互作用¹。然而，纯化的蛋白质通常不能在体外有效相互作用²，³，其中一些在没有结合伴侣^4，5的情况下是不溶的。这些蛋白质可能需要共翻译组装或分子伴侣⁵，⁶，⁷，^8，9的存在。常规下拉的另一个限制是测试结构域之间可能的异多聚化活性，这些结构域可以作为稳定的同源低聚物以共翻译8，^{10的形式存在，}因为它们中的许多在孵育期间不能在体外解离和重新结合。发现共表达有助于克服这些问题^3，11。使用细菌中相容载体的共表达成功用于纯化大型多亚基大分子复合物，包括Polycomb抑制复合物PRC2 12，RNA聚合酶II介质头模块13，噬菌体T4底板14，SAGA复合物去泛素化酶模块^15，16和铁蛋白¹⁷。通常用于共表达的复制起源是ColE1，p15A¹⁸，CloDF13¹⁹和RSF²⁰。在市售的Duet表达系统中，这些来源与不同的抗生素抗性基因和方便的多个克隆位点相结合，产生多顺反子载体，允许表达多达八种蛋白质。这些来源具有不同的拷贝数，可以以不同的组合使用，以实现靶蛋白的平衡表达水平²¹。为了测试蛋白质-蛋白质相互作用，使用了各种亲和标签;最常见的是6x组氨酸，谷胱甘肽-S-转移酶（GST）和麦芽糖结合蛋白（MBP），每种都对相应的树脂具有特定的亲和力。GST和MBP还增强了标记蛋白的溶解度和稳定性²²。

还开发了许多涉及真核细胞中蛋白质共表达的方法，其中最突出的是酵母双杂交测定（Y2H）²³。Y2H测定便宜，简单，并且允许测试多种相互作用;但是，其工作流程需要 1 周以上才能完成。还有一些不太常用的基于哺乳动物细胞的测定，例如荧光双杂交测定（F2H）²⁴ 和细胞阵列蛋白质 – 蛋白质相互作用测定（CAPPIA）²⁵。F2H测定相对较快，允许观察其天然细胞环境中的蛋白质相互作用，但涉及使用昂贵的成像设备。所有这些方法都比原核表达具有优势，可提供天然真核翻译和折叠环境;然而，它们通过转录激活或荧光能量转移间接检测相互作用，这通常会产生伪影。此外，真核细胞可能包含目标蛋白质的其他相互作用伙伴，这可以干扰高等真核生物蛋白质之间二元相互作用的测试。

本研究描述了一种通过常规下拉技术对差异标记蛋白进行细菌共表达的方法。该方法允许研究需要共表达的靶蛋白之间的相互作用。与传统的下拉相比，它更省时，允许对多个目标进行批量测试，这在大多数情况下具有优势。使用兼容载体的共表达比多顺反子共表达更方便，因为它不需要费力的克隆步骤。